2。3。3  金橙II降解酶基因序列分析

将提取的阳性转化子的质粒DNA送测序公司测序，用软件BioEdit进行编辑分析基因序列，将测序结果提交到美国生物技术信息中心数据库NCBI（http://blast。ncbi。nlm。 nih。gov/）中进行核酸的Blast比对。

2。3。4  金橙II降解酶基因重组表达载体pET29a-azo606构建基因片段及表达载体片段的酶切回收

分别提取质粒pMD18T-azo606和表达载体pET29a，同时用限制性内切酶NdeI和XhoI处理这两个质粒。切胶回收基因azo606片段和线性化的表达载体pET29a片段。

酶切体系（10μL）：重蒸水：5μL，质粒pMD18T-azo606或pET29a：3μL，10*H缓冲液Buffer：1μL，XhoI酶：0。5μL，NdeI酶：0。5μL，37℃培养3h。

表达载体pET29a-azo606构建

将基因azo606片段和线性化的表达载体pET29a片段16℃过夜酶连。

酶连体系(10μL)：重蒸水3。5μL，基因azo606片段4μL，载体pET29a片段1μL，T4连接酶0。5μL，T4连接酶10×Buffer 1μL。

2。3。5  表达载体pET29a-azo606转化到感受态E。coil BL21细胞感受态E。coil BL21细胞制备与转化

方法同本文2。3。2

2。3。6  重组表达载体pET29a-azo606的诱导表达

活化重组表达菌株E。coil BL21(pET29a-azo606)，挑取单菌落接种于3mL含50mg/L卡那抗生素的LB试管中，置于37℃条件下，200rpm的摇床上过夜培养。取1mL过夜培养的种子液接种于40mL含50mg/L卡那抗生素的LB培养液中，置于37℃条件下，200rpm的摇床上培养数小时，使菌体浓度的OD600=0。5左右，加入200 μL的0。1M IPTG，置于16℃条件下，150rpm的摇床上过夜振荡培养。5000rpm离心10min,收集菌体，用Tris-HCL(pH8。0)将菌体清洗两遍，再用10ml Tris-HCL(pH8。0)重悬菌体待用。

2。3。7  SDS聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳分析

聚丙烯酰胺凝胶的灌制

参照文献，配制凝胶，并做适当改进。

12%分离胶（15mL）：无菌水4。9mL，30%丙烯酰胺混合液6。0mL，1。5M Tris-HCl(pH8。8) 3。8mL，10%SDS 0。15mL，10%过硫酸铵0。15mL，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺0。012mL。

5%浓缩胶（5mL）：无菌水3。4mL，30%丙烯酰胺混合液0。83mL，1。0M Tris-HCl(pH6。8) 0。63mL，10%SDS 0。05mL，10%过硫酸铵0。05mL，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺0。012mL。

电泳

待凝胶制备好后确认浓缩胶凝固后，轻轻拔去梳子，加入适量的SDS-PAGE电泳缓冲液。每个样品上样量为20μL，连接电源，直至溴酚蓝跑至凝胶底部，然后关闭电源。

染色脱色

电泳结束后，小心取下胶片，自来水漂洗一下，加入适量的考马斯亮蓝R-250染色液，置于微波炉中火加热至几乎沸腾，染色10分钟左右。回收染色液，自来水漂洗一下，加入适量脱色液，置于脱色摇床上振荡脱色，中间更换几次脱色液，直至胶片上条带清晰，也可用脱色液过夜浸泡使脱色更充分。脱色后拍照分析。

2。3。8  Azo606纯化文献综述

在重组表达载体构建过程中，通过引物设计去除基因的终止子，而使用载体上的终止子，使其表达产物带有6*His纯化标签。因重组酶带有6*His纯化标签可用镍柱进行亲和层析纯化。

按本文2。3。6的方法获得重组表达菌株细胞，4℃，12000rpm离心10min收集菌体。用Tris-HCL(pH8。0)洗涤两次后重悬菌体。超声波破碎细胞悬液，4℃，12000rpm离心5min去除细胞碎片。将离心后的含有重组蛋白的上清液加入到含Ni-IDA亲和层析柱中，按Ni-IDA使用方法洗涤洗脱目标重组蛋白。将目标重组蛋白洗脱液转移至透析袋中，用透析缓冲液透析数小时脱盐，期间更换透析缓冲液数次。将纯化获得的Azo606经SDS-PAGE检测分析纯化结果。