海藻酸钠综合性能较好，即凝胶强度好、持水能力强、有韧性、有弹性以及安全无毒的优点，所以本课题选用海藻酸钠作为包埋剂进行研究。

羰基还原酶的种类繁多，用微生物的全细胞对(4-氯苯基)(吡啶-2-基)甲酮(CPMK)进行不对称还原制备(S)-CPMA，(S)-CPMA不溶于水，是合成第二代抗组胺倍他司汀药物的关键中间体。而抗组胺倍他司汀类药物作为一类用于治疗过敏性疾病不可或缺的药物，具有广泛的应用前景，其用量也成井喷趋势增长。具体合成路线见图1：

图1：CPMK不对称还原合成(S)-CPMA路线图

1材料与方法

1。1材料

1。1。1菌种

实验室用Torulopsisglabrata(光滑球拟酵母)来源于创新实验筛选获取。

1。1。2试剂

底物CPMK和其它试剂均为市售分析纯、化学纯或生化试剂。

1。1。3主要仪器设备

立式压力蒸汽灭菌器、超净工作台、生化培养箱、恒温振荡器、分析天平、恒温摇瓶柜、超声波细胞粉碎机、台式离心机、高效液相色谱仪。

1。1。4主要培养基（g/L）

(1)YPD培养基论文网

1%酵母，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂。(2)发酵培养基（g/L）七水合硫酸镁1。5，磷酸二氢钾4，酵母膏20，葡萄糖50，调pH6。0。

1。2实验方法

1。2。1酵母的培养方法来自优I尔Y论S文C网WWw.YoueRw.com 加QQ7520~18766

配置4个YPD培养基（其中3个备用），挑取菌种进行划线接种，后将培养基置于30℃

的恒温箱中培养48小时。再配置5瓶发酵培养基，在250ml三角瓶中接种菌落，并在30℃，

转速180r/min条件下发酵培养24-48h收集菌体[4]。

1。2。2酵母细胞的固定化

培养结束之后离心收集酵母细胞，用0。9%的生理盐水洗涤二次。将海藻酸钠溶于水边搅拌边加热到50℃，冷却至室温静置一段时间，取菌泥混合搅拌均匀，然后用注射器将其滴入无菌的CaCl2溶液中固化4h制成直径约3mm-4mm的球状固定化酶[5]，经蒸馏水洗涤数次，干燥备用。

1。2。3转化的具体方法

在50mL离心管中，将2g固定化酵母细胞悬浮于含有5%(W/V)葡萄糖，2g/LCPMK，0。2M，pH7。0磷酸钾缓冲液并定容至5mL，在30℃，200r/min条件下反应36h后用乙酸乙酯对转化反应液进行萃取，薄层层析检测-分散剂为正己烷/异丙醇(9/1,V/V），再用高效液相色谱仪对实验结果进行分析[6]。文献综述

1。2。3HPLC检测分析方法

使用液相色谱柱，流动相为正己烷：异丙醇（9:1，V/V）。流速1mL/min，柱温25℃，紫外检测波长240nm，进样量10μL，保留时间15min。

1。2。4反应产物e。e。值和剩余底物的计算

产物(S)-CPMA的对映体过量值（e。e。）和剩余底物可由以下算式计算得到：

Cs:液相色谱检测S-CPMA的峰面积；CR1：液相色谱检测R-CPMA的峰面积；CR2：液相色谱检测反应剩余CPMK的峰面积。

2结果与讨论

2。1菌量对羰基还原反应的影响文献综述

配置5个5ml，浓度为2%的海藻酸钠溶液并加热到50℃，冷却至25℃静置一段时间，分别称取离心清洗后的菌泥0。1g，0。25g，0。5g，1。0g以及1。5g进行混合并搅拌均匀，然后用注射器将其滴入无菌的4%CaCl2溶液中固化4h制成直径约为3mm～4mm的球状固定化酶，经蒸馏水洗涤数次，再将得到的固定化小球进行转化培养，进行薄层层析，检测-分散剂为正己烷/异丙醇(9/1,V/V），后将乙酸乙酯萃取后的上清液烘干进行液相色谱分析。论文网

通过液相色谱分析结果表明，在利用微生物细胞作为催化剂进行的不对称还原反应的过程中，反应体系中的菌体量会直接影响参与反应的酶量，从而对产物的生成和反应速度产生影响。