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电热恒温振荡水槽 上海精宏实验设备有限公司 DKZ-1

孵化机 德州市科裕孵化设备有限公司 KFV

2。5 实验动物

实验动物 来源

SPF鸡蛋 国药扬州威客生物工程有限公司

3 实验步骤

3。1 SPF鸡的准备

    从国药扬州威客生物工程有限公司引进一批SPF鸡蛋，在孵化机中37。2℃，70%RH孵化21天。待小鸡破壳后继续置于孵化机之前状态培养，以待小鸡羽毛上水分蒸干。12h后将小鸡转到鸡舍中培养至1日龄以备实验。

3。2 LB培养基中细菌的培养

从-70℃冰箱取出保存的APEC E1株，并将其接种于LB液体培养基中，于37℃静置培养至对数生长期(OD600=0。4～0。8)。

3。3 鸡血中细菌的富集和分离论文网

将5只1日龄SPF鸡(108CFU/只)左胸气囊接种APEC E1，分别在5小时和18小时后采血两次，每次共采血7mL，将血液3000rpm离心5min后，再将上清转移至新的离心管，在室温下12000rpm离心2 min，去上清，将剩余菌体沉淀于液氮中速冻10 min，而后转移到-80℃冰箱中保存待用。

3。4 RNA的提取

2。4。1传统法提RNA

2。4。1。1 鸡血清中细菌RNA的提取

将不同时间采血分离到的细菌从-80℃冰箱中取出，在室温下溶化，先后加入400μL的TES液、400μL的水饱和酚，剧烈振荡混匀，之后置于65℃水浴锅中加热1 h，期间每隔10 min剧烈振荡一次；而后至于冰盒冰浴5 min， 在高速冷冻离心机4℃、12000rpm下离心5 min；将水相转移至一新的1。5 mL灭菌离心管中，加入等体积氯仿抽提一次，置于高速冷冻离心机4℃、12000rpm 离心5 min；再将水相转移至一新1。5 mL灭菌离心管中(约400μL)，加入1/10体积的DEPC水配制的NaAc(3 M，pH5。2)及2。5倍体积的无水乙醇，置于-20℃ 冰箱静置30 min；高速冷冻离心机4℃、12000rpm离心10 min，用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀，室温放置5min晾干，加入50μL DEPC水，在65℃水浴锅加热15 min充分溶解RNA沉淀。

3。4。1。2 LB培养基中细菌RNA的提取

将APEC E1株在LB培养基中静置过夜培养后按上述传统法提RNA。

3。4。2RNAiso plus试剂盒法提RNA

3。4。2。1 鸡血清中细菌RNA的提取

从-80℃冰箱取出保存的菌种，取1ml菌液于1。5ml离心管，12000rpm离心2min后弃上清，在离心管中加入1ml RNAiso plus 反复吹打至无明显沉淀，室温下静置5min后，加入200ul氯仿剧烈震荡15s，待管内液体充分乳化后，室温静置10min，12000rpm离心5min，将上清转移至一新的1。5 mL灭菌离心管，加入等体积的异丙醇上下颠倒混匀，室温静置10min，12000rpm离心10min，小心弃去上清液，沿管壁加入DEPC水配制的75%乙醇，上下颠倒洗涤管壁，12000rpm离心5min后弃上清，吸去残液，室温干燥5min加入50μL RNase Free dH2O，充分溶解沉淀[4]。