2 材料与方法

2。1 实验材料

取自洪泽湖的野生天然水蛭，在实验室中进行培养，实验一周前开始不进食。

2。2 方法

实验观察法

2。2。1 取材

将水蛭放在大的培养皿里，用清水浸没，然后用胶头滴管吸取无水酒精并缓慢滴加，滴加时不可直接滴在水蛭身体上，而应滴加在清水里并缓慢搅匀，直至水蛭身体不再蠕动。然后用解剖工具沿其侧边黑线剪开，取皮肤、嗉囊、直肠、小肠放在5ml离心管里，标号名称。用10%甲醛固定48小时，30%，50%，70%梯度酒精脱水，样品置于70%酒精-20℃保存备用。固定的目的在于使组织硬化，有利于切片[4]。

2。2。2 脱水

含有大量水分的软组织不易切成薄片，因此组织的硬度必须提高。石蜡切片法就是使石蜡渗入组织，以达到支持增硬的作用。然而，水和石蜡不混合，所以在蜡浸渍和嵌入之前，组织中的水必须完全去除，这一步是脱水。常用的脱水剂是酒精。脱水时，将放有10条躯干的网格篮先从放入低浓度的酒精开始，然后，递增浓度，直至无水酒精。具体方法是，将材料经80％酒精→85％酒精→90％酒精→95％酒精（I）→95％酒精（II）→无水酒精（I）→无水酒精（II）,各级酒精40-45min。脱水应彻底，否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。注意在每阶段脱水后，把酒精淋干再放入另一阶段。

2。2。3 透明

酒精与石蜡互不相溶，所以脱水后的材料在浸蜡前必须经过透明。透明剂既可替代组织中的酒精，又能溶解石蜡，以利于石蜡的渗入。二甲苯是常用的一种透明剂[5]。将脱水后的材料经1：1无水酒精与二甲苯→1：2无水酒精与二甲苯→二甲苯（I）→二甲苯(II），各级时间为25min，20min，10min，10min，务使组织达到透明为止。 

2。2。4 浸蜡来自优I尔Q论T文D网WWw.YoueRw.com 加QQ7520~18766

将已透明的材料移入熔化的石蜡内浸渍以去除组织中的透明剂，使石蜡渗入整个组织获得一定的硬度和韧度，有利于切成薄的切片。先将装有56℃石蜡的三个蜡杯放在熔蜡箱内熔化，并使熔蜡箱的温度保持恒定（约58℃），温度切勿太高或太低。然后将透明了的材料放入二甲苯：石蜡1：1→二甲苯：石蜡1:2→石蜡（I）→石蜡(II）。浸蜡时间视材料大小而定，各杯时间分别为20min，20min，1h，1h。 

2。2。5 包埋

将浸蜡后的材料包埋于石蜡中，并使它凝固成蜡块，这一过程称为包埋。包埋前，在4个小杯子中涂抹少量的甘油，然后再倒入热石蜡，随即将已浸蜡的样品切面朝下，垂直放入其中，注意这整个过程中需在保温箱中操作，以防热石蜡凝固，将包埋后的小杯子半浸于冷水中，待石蜡表面凝固后，将小杯子浸入水中冷却。石蜡全部凝固后，拆去小杯子成蜡块。随后，将每个蜡块放入裱有序号的袋子中。石蜡全部凝固后，拆去小杯子即成蜡块。随后，将每个蜡块放入标有序号的袋子中。

2。2。6 切片

切片前，先将蜡块用刀片修整成与小木块同等大小的正方形，否则切出的蜡带弯曲不直，或无法连成带状。将修整后的蜡块用热蜡粘在小木块上，小木块装在切片机上，以待切片。在旋转式切片机上将蜡块切成5um厚的薄片。切下的薄片连成蜡带。用毛笔轻轻取下蜡带，放在蜡带盒内备用。

将蜡片粘贴在载玻片上即为贴片。在载玻片上滴几滴蒸馏水。将蜡带按要求切成适当长度的蜡片，然后轻轻放在载玻片的水面上，再把载玻片放在温度为45℃左右的展片台上。蜡片受热后会慢慢展平。待完全展平后，用解剖针将切片位置拨正，倾去载玻片上的余水后，将其放在烤片盒中，置于50℃左右恒温箱内烤干。