1.1.2  准备供试植物和菌株
供试植物:选取繁殖旺盛,根系生长发达的黑麦草(Lolium multiflorum Lam)作为供试植物。
菲降解功能内生细菌:Pn2,该菌3 d内对菲(100 mg•L-1)的降解率高达99%(本实验室筛选)。
1.2  实验方法
1.2.1  温室盆栽实验
采用温室盆栽法,以南京江宁区距离土壤表面0-20 cm的农田黄棕壤作为供试土壤。其理化性质:pH 6.02,其中碳含量14.3 g•kg-1,黏土含量24.7%,沙含量近七成。将土壤样品风干处理,然后过20目筛,称取1 千克的过筛土壤,将含有菲和芘的丙酮溶液添加至无污染土壤,进行混匀,充分混匀后,最终使土壤中菲和芘的浓度达到100和50 mg•kg-1。一段时间过后,丙酮挥发完毕,将污染后的土壤置于暗处,进行老化,三十天后,将老化污染后土壤取出进行盆栽实验。作为空白对照,设置添加等量丙酮的无污染土壤处理组。
实验设置6种不同处理。(1)未污染土壤+黑麦草(UR);(2)未污染土壤+黑麦草+接菌(URB);(3)污染土壤(CK);(4)污染土壤+接菌(CB);(5)污染土壤+黑麦草(CR);(6)污染土壤+黑麦草+接菌(CRB)。黑麦草种子先用75%乙醇浸泡消毒5分钟后,去除表面杂菌污染,再用去离子水进行清洗,置于恒温培养箱内,培养箱温度设置为30℃,催芽48 h。每盆(350 g土壤)种植一定数量的已经催芽的黑麦草种子,待种子生长至幼苗期,将幼苗进行间苗处理,保证幼苗的生长状况。每一盆留10株长势良好的幼苗继续培养。培养箱设置为恒温,白昼20℃,湿度为50%。培养过程中按实际情况需要加入霍格兰营养液,保证土壤养分充足。待植株高度约10 cm时,在植株根部的土壤中接种OD600 nm为2.0的菲降解菌株Pn2的菌悬液(20 mL),培养30 天,收集植物样品。为了保证实验数据真实可靠,每一组均做三个重复。
1.3  实验分析方法
1.3.1  测定植物的生物量
将采集后植物样品用剪刀把根和茎叶进行分离,用无菌水进行冲洗,冲洗完毕后再用滤纸,挤压并吸干植物表面残存水,先测定植物根、茎叶的鲜重,再将植物放入泠藏室,冷冻三天后取出测出植物根与茎叶的干重。
1.3.2  测定功能内生细菌的定殖数量
称量一定重量的植物样品,用无菌水充分冲洗,冲洗完全后将样品置于超净台内,用一定浓度的乙醇漂洗一段时间,再用无菌水进行冲洗。把植株放入高温灭菌后的研钵,加入5 mL蒸馏水,研磨充分。吸取1 mL上清液,进行梯度稀释,并涂布于菲降解固体培养基平板上(氨苄青霉素和氯霉素的浓度均为20 mg•L-1),将培养基放入保温箱恒温培养保温箱温度设定为30摄氏度,待平板上长出明显的菌落。
1.3.3  土壤和植物体内PAHs含量的测量
测量土壤和植物样品中菲和芘浓度的方法参照文献,大致如下:(1)冷冻干燥样品,研磨粉碎(2)每个样品超声萃取三次样品(3)萃取液收集过柱子净化先(4)洗脱(5)旋转蒸发洗脱液,用甲醇定容(6)用液相色谱法进行定量分析
植物体内PAHs积累量(A):A = C × M,C (mg•kg–1)表示植物根或茎叶中PAHs浓度,M (g•pot–1, 干重)表示每盆植物根或茎叶的干重。植物体内PAHs的富集系数(PCF):PCF = Cp / Cs,Cp表示植物体内PAHs浓度,Cs表示土壤中PAHs浓度。PAHs在植物体内的传导系数(TF):TF = SCF / RCF,SCF表示植物茎叶中PAHs的富集系数,RCF表示植物根中PAHs的富集系数。
1.4  数据处理分析
用SPSS统计软件处理实验数据,用Excel进行图表的绘制。
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