实验所用的试剂盒能够从各种类型的琼脂糖凝胶之中回收最多达到8微克DNA,回收的比例为60-85%。可纯化获得纯度非常高的DNA,而且可以使其片段完整并具有很高的生物活性,该片段可以直接用于许多分子生物学实验,例如:PCR扩增、测序和体外转录等。
Buffer DE-A:是凝胶的熔化剂,含有DNA保护剂,以防高温条件下DNA的降解,室温条件下密封储藏。
Buffer DE-B:是结合液,能够促进70bp以上DNA片段选择性的结合于DNA制备膜之上,室温条件下密封储藏。
Buffer W1:是洗涤液,室温密闭贮存。
Buffer W2 concentrate:是去盐液,试剂瓶上有指定体积的说明,按照说明加入无水乙醇,充分混匀,室温条件下密封储藏。
Eluent:洗脱液,室温密闭贮存。
1.4.2目的片段的回收和克隆实验步骤
使用 DNA 凝胶回收试剂盒 (AXYGEN)对扩增后特异性的片段进行回收操作,具体如下:先将无水乙醇(试剂瓶上指定的体积)加入到Buffer W2 concentrate中;提前准备好没有核酸污染并且没有核酸酶污染的离心管和Tip头;准备好75摄氏度水浴;检查Buffer DE-B有没有不溶性沉淀产生,如果有沉淀,则在70摄氏度水浴加热直至沉淀消失,然后将其冷却达到室内温度以后再进行实验。把含有目的DNA的琼脂糖凝胶在紫外灯照射下切去,用吸水纸充分吸收凝胶表面上的液体然后将其切碎,算出凝胶的质量,这个质量当作一个凝胶体积;加入三个凝胶体积的Buffer DE-A,充分混匀后在75摄氏度环境中加热,间断混合,直至凝胶块完全熔化;加入0.5个Buffer DE-B,混合均匀,直到DNA片段不到400bp的时候,然后加入一个凝胶体积的异丙醇;吸取上一步所得的混合溶液,在DNA制备管之中加入此混合溶液,离心操作1分钟,12000*g,而后舍弃过滤溶液;把制备管置回离心管,加入500微升Buffer W1,离心操作30秒,12000*g,而后舍弃过滤溶液;把制备管置回离心管,加入700微升Buffer W2,离心操作30秒,12000*g,而后舍弃过滤溶液;再次使用上述实验方法,然后用700微升Buffer W2清洗一次12000*g离心操作1分钟;将制备管置回离心管,离心操作1分钟,12000*g;将制备管置于干净的1.5毫升规格的离心管之中,加25到30微升Eluent或去离子水于制备膜的中心部位,将其放置1分钟,温度为室温,最后12000*g离心操作1分钟洗脱DNA。
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