高RA甜叶菊辅助选择育种EST-SSR分子标记开发(2)
图8 4号引物以单个材料为模板PCR反应后PAGE电泳结果 12
图9 20号引物以单个材料为模板PCR反应后PAGE电泳结果 12
图10 58号引物以单个材料为模板PCR反应后PAGE电泳结果 12
图11 68号引物以单个材料为模板PCR反应后PAGE电泳结果 13
图12 三大群体聚类 14
图13 23个个体聚类 14
图14 31号引物以单个材料为模板PCR结果 15
图19 31号引物以单个材料为模板PAGE电泳结果 15
表1 甜叶菊中糖苷含量情况 3
表2 8%聚丙烯酰胺凝胶配方 4
表3 DNA浓度 5
表4 具有多态性的19对EST-SSR引物详细信息 8
表5 以半池为模板所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳的遗传相似系数和遗传距离 13
表6 以半池为模板所得PCR产物经PAGE电泳的遗传相似系数和遗传距离 13
表7 以个体为模板所得PCR产物经PAGE电泳的总体遗传相似系数和遗传距离 13
表8 甜叶菊遗传多样性 15
高RA甜叶菊辅助选择育种EST-SSR分子标记开发
甜叶菊（S. rebaudiana）原产地并非中国，而是巴拉圭，因此甜叶菊产业在中国起步较晚。甜叶菊作为一种以叶片为主要经济来源的农作物，属于菊科草本植物[1]，并且多年生，因此可以产生较好的经济效益。甜叶菊成为目前主要经济作物的原因是在其体内含有多种糖苷。据相关报道称，到目前为止，就已经在其叶片中检测到四十多种甜菊糖苷[2-4]。甜叶菊中的糖苷种类众多，但并非每一种都可以用于商品生产，由于糖苷的结构不同，人们对其觉上的感知也会有所不同，甜叶菊中的糖苷以莱鲍迪苷A（RA）和甜菊苷（STV）为主[5-6]，就这两种糖苷而言，STV在入口过后，往往伴随着后苦，而RA口感纯正，跟蔗糖口比较接近[9]。甜菊糖苷的应用之所以越来越广，是因为它有着高甜度低热量的优良特性，以甜菊苷为例，与蔗糖相比，其甜度高出蔗糖300倍，而蔗糖的热量却高出甜菊苷的300倍，如此大的悬殊造就了甜菊糖苷作为一种甜添加剂的优良特性，并且甜菊糖苷也日益广泛地应用于饮品、甜点等多种食品生产行业。随着全球经济的发展，人们的生活水平也日益提高，营养的摄入量也随之增加，在人群中肥胖症、糖尿病和高血压的发病率也在逐年攀升。通过众多关于甜叶菊的相关药理学研究结果表明，正常人每天摄入适当的甜菊糖苷，对人体不但没有副作用，而且对于治疗这些因营养过剩所致疾病有着辅助治疗的作用[8]。现在，随着人们对于甜叶菊的认可度越来越高，并且美国FDA和欧盟食品安全局已经承认了RA可以作为“第三糖源”，因此培育出高RA含量的甜叶菊新品种将对甜叶菊产业的发展提供很大的推动力[11]。
由于传统育苗存在诸多弊端，常规的甜叶菊育种周期长、消耗大，甜菊糖苷含量准确的测定仅能在花期进行，同时检测效率低下。如果能够探索出一种高效、准确的选育新方法对高RA的甜叶菊育种工作将大大推进。随着对分子生物学研究的不断进展， EST-SSR分子标记也随之兴起，并广泛应用于各种植物的研究。由于EST位于编码区，在一定程度上可以反映基因表达的情况,因此就可以利用SSR引物所得到产物的多态性，利用相关基因分析软件，从而获得可以筛选出研究所需特定性状的SSR引物，在此基础上就可以作为指导作物遗传育种的一种捷径[12]。EST-SSR之所以被广泛应用于分子标记辅助育种，是因为这种标记有着快速、简便并且成本低、重现性好等诸多优点[13]。本实验通过明确甜叶菊EST 序列中 SSR 的总体特点，进而开发与甜叶菊RA密切相关的 EST-SSR 引物，实现在苗期便可初步推断出甜叶菊RA含量的情况，为今后甜叶菊标记辅助育种、品种分类和新品种保护等研究奠定基础。
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