猪皮肤成纤维细胞骨髓细胞和卵巢颗粒细胞的分离培养(2)
颗粒细胞是卵泡中卵母细胞周围一层菱形或扁平细胞，其细胞浆内含有颗粒。颗粒细胞是卵泡中最大细胞群，原始卵泡中非增长的卵母细胞周围是扁平的颗粒细胞，成熟卵母细胞周围围绕的颗粒细胞为立方型[31]。颗粒细胞的胞核大而圆，着色深。本实验室每周都会进行采卵，采集方便，颗粒细胞多，所以颗粒细胞易得，进行颗粒细胞培养比较方便，也可熟悉细胞培养技术。
骨髓是存在于长骨（如肱骨、股骨）的骨髓腔，扁平骨（如胸骨、肋骨）和不规则骨（髂骨、脊椎骨等）的松质骨间网眼中的一种海绵状的组织，骨髓细胞则是一群存在于骨髓中多种细胞，分有脂肪细胞、骨髓巨核细胞、髓细胞、红细胞、网状细胞等。而且骨髓细胞来源方便，易于分离、培养。
目前大部分研究都以猪的胎儿成纤文细胞和颗粒细胞作为供体细胞，也有将猪皮肤成纤文细胞、心肌细胞作为供体细胞获得核移植后代的报道[32]。许多实验室正在通过建立动物的成纤文细胞库来保存畜禽种质资源。包括我国在内的许多国家建立了用于统一保藏典型培养物的“培养物银行”或者保存中心。英国与瑞士( 日内瓦) 所经营的欧洲动物细胞培养中心, 细胞库经营 1600 种以上的细胞系。美国的资源保藏中心致力于分离、收集、保存及供应可靠的细胞系, 任何经鉴定的典型培养物都可以申请登记、贮存、随时取用, 甚至交换进行商业供应[33]。猪的皮肤成纤文细胞、卵巢颗粒细胞和骨髓细胞来源方便，培养技术成熟，可较好地保存猪种遗传资源，本实验拟尝试建立这三种细胞系，来探讨保存江苏不同地方猪品种的遗传资源的可行性。
1 材料和方法
1.1材料
1.1.1猪耳和猪尾组织样品 从江苏淮安一养猪场屠宰商品猪剪下来猪耳组织和尾巴。75%医用酒精清洗耳部边缘，待挥发干后，用灭菌的耳号钳剪取 3 cm×4 cm 的组织块，放入含生理盐水中，用装有冰块的泡沫盒尽快带回实验室。尾巴则取一整根。
猪股骨样品 从南京华联超市买一猪股骨，带回实验室。
猪卵巢颗粒细胞样品 卵巢置于生理盐水中，水浴保温，用注射器抽取卵泡液。
1.1.2主要试剂和仪器
DMEM溶液（高糖）、胰酶、胎牛血清（FBS）、PBS购自Gibco 公司、超净无菌操作台、离心机、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、电热鼓风干燥箱、冰柜、电子天平、恒温水浴槽、20ml培养瓶、24孔细胞培养板。
1.2方法
1.2.1成纤文细胞的取材及处理 超净台上将组织块用75%的酒精中浸泡消毒，在用PBS清洗，刮去毛和表皮，用含10%双抗的PBS清洗，去除多余脂肪和软骨，保留真皮层，用含双抗的PBS清洗后，在湿润状态下用灭菌眼科剪刀将组织块剪成小块，放于含少量PBS的1.5ml的离心管中继续将组织块剪碎。
1.2.1.1组织块培养法 加含2%双抗的PBS于离心管中混匀，5000r/min离心3min，去上清液，再加含2%双抗的PBS离心管中，离心5000r/min 3min，去上清液，加1ml的培养基（DMEM+20%FBS+600ul双抗）于离心管中，混匀，离心5000r/min 3min，去上清液，再加1ml含20%胎牛血清的培养基于离心管中，将组织均匀放置在培养瓶中，加3ml的含20%胎牛血清的培养基，放在 37 ℃、5%CO2 、饱和湿度培养箱中培养。
1.2.1.2成纤文细胞胰酶消化法 将剪碎的组织块放入加有400ul胰酶的1.5ml离心管中，剪碎1min，消化3min，离心5000r/min 3min，去上清液，加1ml含20%胎牛血清的培养基于离心管中，组织均匀放置在20ml的培养瓶中，加3ml的含20%胎牛血清的培养基，放在 37 ℃、5%CO2 、饱和湿度培养箱中培养。4天后换液，以后每2d更换一次培养液。