蚂蟥冬眠过程中糖蛋白质脂肪代谢和内在品质的研究(2)
蚂蟥是变温动物，在温度较低时会进入冬眠，改变原有的生理活动，这在很大程度上影响了蚂蟥养殖产业的生产效率和经济效益。“冬眠”是动物为了适应自然环境的变化，文持个体生存的一种特殊生理现象。冬眠期间变温动物体温降低、新陈代谢降到最低限度、呼吸频率降低。动物在冬眠过程中能量利用策略等生理生化过程会有调整，代谢减退，在极大程度影响其生长、生存性能指标。目前关于宽体金线蛭的研究大多集中在对其遗传多样性[10-11]、呼吸生理[12]、消化生理[13-14]、组织结构[15]、影响内在品质相关因素[16-17]等方面。而尚未有冬眠期间宽体金线蛭生长性能[18]、体组成和内在品质变化的研究。本实验将测定蚂蟥冬眠期间体组成指标变化，探究蚂蟥冬眠过程中能量利用策略。以进一步理解蚂蟥冬眠的生理学意义，以及冬眠过程中蚂蟥生理变化，为人工养殖蚂蟥安全高效越冬提供更多参考依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
成龄蚂蟥由南京农业大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）。
1.2 实验药品与仪器
苯酚，3,5—二硝基水杨酸，硫酸铜，酒石酸钾纳，亚硫酸钠，浓硫酸，葡萄糖标准试剂，硫酸钾，盐酸，（牛）纤文蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，40%氢氧化钠溶液，4%硼酸溶液，甲基红甲基蓝混合溶液，DNS，氢氧化钠溶液, 结晶酚， 40单位的凝血酶溶液标准品，等试剂。
Foss 蛋白质测定仪（瑞典）FA1104，FYL-YS-108L低温保存箱（北京福意电器有限公司），XHF-D内切式匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司），5810R离心机（Eppendorf公司），Alpha-1506型紫外可见分光光度计（上海谱元仪器有限公司），ZD-2型自动电位滴定仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）、分析天平（上海精科天平），等试验仪器。
1.3 实验方法
1.3.1 实验样品准备
建立人工低温下蚂蟥冬眠模型[19]：实验用蚂蟥统一暂提前7d养于透明玻璃缸中。实验前停食2d，随机选取10g左右的蚂蟥90条，3条蚂蟥为一组。随机分组，置于480ml注水2/3体积的广口玻璃瓶中，共设置30组。初始温度为25℃，以1℃/ d的速率降温至4℃，稳定温度于4℃，蚂蟥在4℃时即进入冬眠状态。试验期间不投喂食物，使用虹吸法每天换1/2 体积，已经4℃预冷且曝气的自来水。
于25℃养殖停食2 d后，以及人工降温进入冬眠的蚂蟥在0、30、60 d分别取样，各个时期分别记为ST、H0、H30、H60。每次取样，取各时期蚂蟥6条，每组两条蚂蟥，重复实验三次。将蚂蟥处死后冰浴中进行匀浆，进行后续的实验操作。
1.3.2 样品的水分测定
采用直接烘干法测定：中取三只生长情况较均匀的蚂蟥称重，记录质量m1，将蚂蟥放入沸水烫死，放入55℃烘箱中烘24小时烘干至衡重，称重记录质量m2，蚂蟥折干率= m2/m1×100%。
1.3.3 样品的灰分测定
采用《中国药典》中灰分测定法[20]：准备坩埚：根据样品数目准备相应个数的洁净坩埚，并且用铅笔在坩埚上标记好编号，记录坩锅质量m1；
样品预处理：取适量已经烘干至衡重的水蛭粉末放入坩埚中，称重记录质量m2；
碳化处理：将坩锅置于电炉，半盖坩锅盖加热使样品在通气情况下逐渐碳化，直到无黑烟产生；
灰化处理：碳化后，把坩埚移入马弗炉中，将马弗炉逐渐升温至550℃，并且在550℃保持4h将样品完全灰化，将马弗炉断电自然冷却，等炉内温度降至200℃后再小心取出坩埚，及时移入干燥器内，待坩埚及样品降至室温再进行称重，记录质量m3；计算灰分：灰分=（m3- m1）/（m2- m1）×100%。