蚂蟥是变温动物,在温度较低时会进入冬眠,改变原有的生理活动,这在很大程度上影响了蚂蟥养殖产业的生产效率和经济效益。“冬眠”是动物为了适应自然环境的变化,文持个体生存的一种特殊生理现象。冬眠期间变温动物体温降低、新陈代谢降到最低限度、呼吸频率降低。动物在冬眠过程中能量利用策略等生理生化过程会有调整,代谢减退,在极大程度影响其生长、生存性能指标。目前关于宽体金线蛭的研究大多集中在对其遗传多样性[10-11]、呼吸生理[12]、消化生理[13-14]、组织结构[15]、影响内在品质相关因素[16-17]等方面。而尚未有冬眠期间宽体金线蛭生长性能[18]、体组成和内在品质变化的研究。本实验将测定蚂蟥冬眠期间体组成指标变化,探究蚂蟥冬眠过程中能量利用策略。以进一步理解蚂蟥冬眠的生理学意义,以及冬眠过程中蚂蟥生理变化,为人工养殖蚂蟥安全高效越冬提供更多参考依据。
1  材料与方法
1.1  实验材料
成龄蚂蟥由南京农业大学中药材研究所提供,经郭巧生教授鉴定为蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)。
1.2  实验药品与仪器
苯酚,3,5—二硝基水杨酸,硫酸铜,酒石酸钾纳,亚硫酸钠,浓硫酸,葡萄糖标准试剂,硫酸钾,盐酸,(牛)纤文蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液,40%氢氧化钠溶液,4%硼酸溶液,甲基红甲基蓝混合溶液,DNS,氢氧化钠溶液, 结晶酚, 40单位的凝血酶溶液标准品,等试剂。
Foss 蛋白质测定仪(瑞典)FA1104,FYL-YS-108L低温保存箱(北京福意电器有限公司),XHF-D内切式匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司),5810R离心机(Eppendorf公司),Alpha-1506型紫外可见分光光度计(上海谱元仪器有限公司),ZD-2型自动电位滴定仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)、分析天平(上海精科天平),等试验仪器。
1.3  实验方法
1.3.1  实验样品准备
建立人工低温下蚂蟥冬眠模型[19]:实验用蚂蟥统一暂提前7d养于透明玻璃缸中。实验前停食2d,随机选取10g左右的蚂蟥90条,3条蚂蟥为一组。随机分组,置于480ml注水2/3体积的广口玻璃瓶中,共设置30组。初始温度为25℃,以1℃/ d的速率降温至4℃,稳定温度于4℃,蚂蟥在4℃时即进入冬眠状态。试验期间不投喂食物,使用虹吸法每天换1/2 体积,已经4℃预冷且曝气的自来水。
于25℃养殖停食2 d后,以及人工降温进入冬眠的蚂蟥在0、30、60 d分别取样,各个时期分别记为ST、H0、H30、H60。每次取样,取各时期蚂蟥6条,每组两条蚂蟥,重复实验三次。将蚂蟥处死后冰浴中进行匀浆,进行后续的实验操作。
1.3.2  样品的水分测定
采用直接烘干法测定:中取三只生长情况较均匀的蚂蟥称重,记录质量m1,将蚂蟥放入沸水烫死,放入55℃烘箱中烘24小时烘干至衡重,称重记录质量m2,蚂蟥折干率= m2/m1×100%。
1.3.3  样品的灰分测定
采用《中国药典》中灰分测定法[20]:准备坩埚:根据样品数目准备相应个数的洁净坩埚,并且用铅笔在坩埚上标记好编号,记录坩锅质量m1;
样品预处理:取适量已经烘干至衡重的水蛭粉末放入坩埚中,称重记录质量m2;
碳化处理:将坩锅置于电炉,半盖坩锅盖加热使样品在通气情况下逐渐碳化,直到无黑烟产生;
灰化处理:碳化后,把坩埚移入马弗炉中,将马弗炉逐渐升温至550℃,并且在550℃保持4h将样品完全灰化,将马弗炉断电自然冷却,等炉内温度降至200℃后再小心取出坩埚,及时移入干燥器内,待坩埚及样品降至室温再进行称重,记录质量m3;计算灰分:灰分=(m3- m1)/(m2- m1)×100%。
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