转录因子SPL9在葡萄果实发育过程中的功能分析(3)
1 材料与方法
1．1 试验材料
葡萄栽培品种‘藤稔’，采集花后2周、花后4周、花后6周、花后8周、花后10周、花后12周、花后14周的葡萄果实用于SPL9表达水平分析的实验。采样后用液氮将采得的葡萄果实迅速冷冻，在-80℃超低温冰箱里保存以备接下来实验使用。
1．2 葡萄果实RNA提取
提取葡萄果实RNA采用华越洋生物（北京）科技有限公司生产的多糖多酚植物专用RNA提取试剂盒（Quick RNA isolation Kit）和本研究室改进的果实多糖多酚总 RNA 提取方法相结合的方法。
1．3 mRNA的分离与纯化
mRNA的分离采用本研究室成功改良的氯化锂RNA分离方法；mRNA的纯化利用Promega公司的PolyATtract mRNA Isolation System Ⅲ试剂盒。
1．4 实时荧光定量PCR分析
先采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）分析的方法鉴定SPL在葡萄果实发育的不同阶段的表达水平。RT-PCR 试验采用宝生物公司的 SYBR R Premix Ex TaqTM实时定量 PCR 试剂盒(DRR041)。 PCR程序采用三步法，先进行8 个循环的降温 PCR，接着进行 35-40 个循环的常规 PCR，在每一次循环退火步骤采集各管的荧光信号，绘其熔点曲线。各个样品都对内参基因 U6 平行做3次重复，CT值用 Rotor-Gene6000 软件 1.7 版本的△△CT法转换成相对表达量，具体公式为：
相对表达量=2（-△△CT），△△CT=(△CT 测验样本-△CT 对照)
测验样本或对照样本的△CT=CT(mRNA)-CT(U6)。
所用引物：上游引物：5‘-ATCCCGAGAGGGATACTTGG-3’；下游引物：5‘-AGAGAGGATTCTCAGAGTTG-3’。
1．5 超表达载体构建及果实瞬时表达体系
SPL基因全长的扩增引物：
上游引物：5‘-TCTAGAATGGAAAGGGGTTCGAGCTC-3’；
下游引物：5‘-GAGCTCCTAAAGTGACCAGTGCATCTG-3’。下划线为酶切位点。
1．5．1 感受态细胞的制备——氯化钙法
1) 挑取大肠杆菌单菌落，把它接种到含有4ml LB液体培养基的试管中， 在37℃条件下培养6小时；
2) 取800μl菌液于100ml的LB培养基中， 37℃震荡培养2-3h，直至OD600达0.3-0.5；
3) 将40ml上述培养物于无菌条件下移动至50ml预冷的离心管， 放到冰盒上约12min；
4) 在4℃下，4000g离心10min，弃上清后收集菌体沉淀；
5) 每管加10ml预冷的100mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris.HCl (PH8.0)溶液重悬细胞，冰30min；
6) 4℃，4000g离心10min，弃上清，收集菌体沉淀；
7) 每管沉淀用2ml预冷的100mmol/L CaCl2，0mmol/L Tris.HCl (PH8.0)溶液轻轻悬浮， 置于4℃，在24h内现用。或者将终浓度为20%的甘油加进去，将它混合均匀后分装为200μl每管，在37℃中保存备用
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