盐胁迫下大岛野路菊形态及组织结构的变化(2)
1 材料与方法
1．1 材料
根据管志勇等（2010b）和施晓梦等（2014）对菊属植物耐盐性的研究结果，本文选择耐盐的大岛野路菊进行研究。材料由南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”提供。
1．2 材料培养方法
试验于2015到2017年进行，共重复实验3次。采集生长良好的大岛野路菊嫩稍扦插于基质（蛭石:珍珠岩:营养土=1:1:1）中。插穗生根并展开6-7片叶后，挑选生长均匀一致的植株移栽并水培于塑料周转箱（体积20 L）内，用Hoagland营养液培养，气泵24 h•d-1 通气。缓苗生长7 d后，待用。试验一将生根苗分别置于0（CK），80，120，200mM NaCl（S）的Hoagland营养液中培养，每处理25株。试验二将生根苗分别置于0（CK），和120mM NaCl（S）的Hoagland营养液中，每处理25株。
1．3 整株形态变化的记录
在生长过程进行观察拍照，拍照时间点为0 d, 5 d, 10 d, 20 d。并在处理前和盐胁迫30 d时，在各组中各随机选取15株，分别对株高，鲜重，干重，叶片数量，分枝长度，分枝叶片数量，枯叶数，茎粗等进行测量。其数据用SPSS 20统计软件进行单因素方差分析，对平均数进行独立样本T-检验（P≤0.05）。
1．4 叶片大小的测量
采用了描叶称重法确定其面积[7]，从顶端数第一、第三及从基部数第五片叶片在确保不造成损伤的情况下在A4纸上进行描叶，然后剪下称重，依据重量比就是面积比，以此换算出叶片面积。
1．5石蜡切片制作
分别在0 d, 5 d, 10 d, 和 20 d取胁迫和对照植株的从顶端数第四片展开叶，取避开叶脉的叶上同一位置取样，将其切成0.3×0.3 cm的小块，用FAA固定液固定。随后样品用梯度浓度的酒精脱水，再用梯度浓度的二甲苯替换出酒精，然后包埋于石蜡中。用切片机将包埋好的叶片横切成25 μm的薄片，并用0.1%的甲苯胺蓝(w/v)染色。切片，并用Smarscape 2002软件进行拍照以及叶片厚度的测量[8]。每切片观察10个视野，每个品种观察4-5个切片。并取盐胁迫30 d的胁迫和对照植株的从顶端数第四片展开叶的叶柄中段，以及侧枝的顶端数第三节和主枝的顶端做石蜡切片，试验方法同上。
1．6 叶片气孔、表皮细胞以及栅栏组织细胞的观察
分别在0 d, 5 d, 10 d, 和 20 d取胁迫和对照植株的叶片，将其泡入漂白剂（50g/L次氯酸钠和13g/L氢氧化钠）中，浸泡至透明后，便可用Olympus BX41显微镜观察气孔、表皮细胞以及栅栏组织细胞并拍照[9]。叶片取样位置及计数方法同上。
1．7 扫描电镜观察
在胁迫30 d后，分别取对照与胁迫植株顶端以下的第四片完全展开叶，用刀片在其相同的部位（蜡质观察上表皮，表皮毛分别避开叶脉和不避开叶脉观察下表皮，腺体在去除表皮毛后观察上、下表皮）切取为约为0.3×0.3 cm的小块，根据扫描电镜常规的样品制备方法[10]，用2.5%戊二醛（0.1 M磷酸缓冲液PH 7.2）进行固定、抽气，再经乙醇梯度脱水，临界点干燥（蜡质观察为将样品保存于液氮中，随后冷冻干燥以避免乙醇溶解蜡质），离子镀膜，然后在扫描电子显微镜下观察、拍照。每个切片观察10个视野，每个实验观察4-5个切片。
1．8 数据分析
试验数据使用SPSS 20统计软件进行单因素方差分析（P<0.05），采用Microsoft Excel 2007软件绘图。
2 结果与分析
2．1 大岛野路菊在不同盐浓度下的生长情况
图1为大岛野路菊植株在不同盐浓度下生长30 d的生长状况，图中可以看出，与对照相比，盐胁迫抑制了大岛野路菊的生长，且随着盐处理浓度的提高，影响越来越大。植株还出现基部叶片枯萎脱落，生长部位叶片表现出明显的增厚、增大现象。
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