Total RNA
RNase free dH2O    1
1
5 μg 以下
Up to 10
b. 65℃保温5 min后,冰上迅速冷却。(上述处理可使模板RNA变性,提高反转录效率。)
c.在上述Microtube管中配制下列反转录反应液,总量为20 μl。
表:反转录反应液
试剂
Contents    用量
Dosage of contents/μl
上述变性后反应液
5×PrimeScriptⅡBuffer
RNase Inhibitor (40U/μl)
PrimeScriptⅡRTase (200U/μl)
RNase free dH2O    10
4
0.5 (20 U)
1 (200 U)
Up to 20
d.缓慢混匀。
e.进行反转录反应:42℃ 30~60 min。
f.95℃反应 5 min(酶失活)后,冰上冷却,得到的cDNA溶液可以直接用于RT-PCR模板或放置-20℃保存。
(4) 目的基因克隆
PCR扩增目的基因,后使用PCR产物回收试剂盒回收。
1.2.2 重组质粒的构建
(1) 重组质粒的构建
根据克隆得到的大豆基因的ORF序列和载体图谱设计带有酶切位点的引物,用LA Taq酶进行PCR扩增基因编码区(CDs)序列。扩增产物酶切回收后用T4酶分别与载体(酵母表达:pYES2;植物过表达:super1300和super1300GFP)进行连接,连接产物转入DH5α感受态中,挑取阳性克隆PCR验证后测序,测序正确的阳性克隆提取质粒。重组质粒与空载体质粒转化相应的感受态细胞(酵母表达:酵母各野生型及突变体;植物过表达:土壤农杆菌),挑取阳性单菌落进行PCR验证,验证正确的菌体储存备用。
(2)所需培养基配方
    YPDA完全培养基从clontech公司购买,其配方为:2%蛋白胨(w/v)、1%酵母抽提物(w/v)、2%葡萄糖(w/v)、0.2%半硫酸腺嘌呤(w/v)(固体培养基另加2%琼脂)。
选择培养基SD-ura:从clontech公司购买minimal SD base,加入1*-ura Dropout Supplement。在诱导表达时,配置的培养基须额外加入2% Gal,1%Raf。(固体培养基另加2%琼脂)。MS培养基配方为:商品化的MS4.43g/L,3%蔗糖(w/v),固体需加1%琼脂粉,pH调至5.8左右。
    1.2.3 大豆目的基因在酵母中的功能验证
(1) 酵母的Ni盐敏感性回补验证
a.将目的菌体在5mlSD-ura中培养12hr左后,以约1:50转接入30mlSD-ura诱导培养至对数生长初期(OD600=0.8-1.0)。
b.取菌液,十倍梯度稀释。从原液开始依次取10μl在含有3mM NiSO4的SD-ura培养基上点斑。
c.30°C恒温箱中倒置培养3-4天后观察并拍照。
(2) 酵母的NBD-PC转运激光共聚焦观察
a.将目的菌体在5mlSD-ura中培养12hr左后,以约1:50转接入30mlSD-ura中诱导培养至对数生长初期(OD600=0.8-1.0)。
b.取10ml菌液加入约88μl NBD-PC,振荡培养20min左右加入FM4-64继续培养约25min。
c.收集菌体后在4ml含NaN3的SD-ura培养基中洗涤2次。
d.用激光共聚焦显微镜观察荧光。

1.2.4 拟南芥的培育及目的基因在拟南芥中基因功能验证
(1) 浸花法侵染。
将转入重组质粒(GmYbt1-A-1300,GmYbt1-A-1300GFP,GmYbt1-B-1300,和GmYbt1-B-1300GFP)的农杆菌接入YEP液体培养基中,在28℃摇床中培育,12000×g离心收集菌体,用配置的侵染液(1/2 MS液体培养基中加入5%蔗糖)重悬使其OD600值在0.6-0.8之间,加入SILWETL-77表面活性剂,对拟南芥幼苗盛开的花进行侵染。侵染所用的拟南芥幼苗为野生型哥伦比亚0型。侵染的频率为两天侵染一次,直至不再有新的花长出。等苗成熟后,收获F1代种子。
(2)     F1代种子进行筛选。
将F1代种子种植在终浓度为25 mg/L潮霉素(Hyg)的MS固体培养基上进行筛选,并且统计性状分离比(长根数量:短根数量),挑选性状分离比接近3:1的株系进行土培,收获F2代种子。
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