大豆ABC（ATP-Binding Cassette）转运蛋白基因在脂质分泌中的功能研究(3)
Total RNA
RNase free dH2O 1
1
5 μg 以下
Up to 10
b. 65℃保温5 min后，冰上迅速冷却。（上述处理可使模板RNA变性，提高反转录效率。）
c.在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，总量为20 μl。
表：反转录反应液
试剂
Contents 用量
Dosage of contents/μl
上述变性后反应液
5×PrimeScriptⅡBuffer
RNase Inhibitor (40U/μl)
PrimeScriptⅡRTase (200U/μl)
RNase free dH2O 10
4
0.5 (20 U)
1 (200 U)
Up to 20
d.缓慢混匀。
e.进行反转录反应：42℃ 30~60 min。
f.95℃反应 5 min（酶失活）后，冰上冷却，得到的cDNA溶液可以直接用于RT-PCR模板或放置-20℃保存。
(4) 目的基因克隆
PCR扩增目的基因，后使用PCR产物回收试剂盒回收。
1.2.2 重组质粒的构建
(1) 重组质粒的构建
根据克隆得到的大豆基因的ORF序列和载体图谱设计带有酶切位点的引物，用LA Taq酶进行PCR扩增基因编码区（CDs）序列。扩增产物酶切回收后用T4酶分别与载体（酵母表达：pYES2；植物过表达：super1300和super1300GFP）进行连接，连接产物转入DH5α感受态中，挑取阳性克隆PCR验证后测序，测序正确的阳性克隆提取质粒。重组质粒与空载体质粒转化相应的感受态细胞（酵母表达：酵母各野生型及突变体；植物过表达：土壤农杆菌），挑取阳性单菌落进行PCR验证，验证正确的菌体储存备用。
（2）所需培养基配方
YPDA完全培养基从clontech公司购买，其配方为：2%蛋白胨（w/v）、1%酵母抽提物(w/v)、2%葡萄糖(w/v)、0.2%半硫酸腺嘌呤（w/v）（固体培养基另加2%琼脂）。
选择培养基SD-ura：从clontech公司购买minimal SD base，加入1*-ura Dropout Supplement。在诱导表达时，配置的培养基须额外加入2% Gal，1%Raf。（固体培养基另加2%琼脂）。MS培养基配方为：商品化的MS4.43g/L，3%蔗糖（w/v），固体需加1%琼脂粉，pH调至5.8左右。
1.2.3 大豆目的基因在酵母中的功能验证
(1) 酵母的Ni盐敏感性回补验证
a.将目的菌体在5mlSD-ura中培养12hr左后，以约1:50转接入30mlSD-ura诱导培养至对数生长初期（OD600=0.8-1.0）。
b.取菌液，十倍梯度稀释。从原液开始依次取10μl在含有3mM NiSO4的SD-ura培养基上点斑。
c.30°C恒温箱中倒置培养3-4天后观察并拍照。
(2) 酵母的NBD-PC转运激光共聚焦观察
a.将目的菌体在5mlSD-ura中培养12hr左后，以约1:50转接入30mlSD-ura中诱导培养至对数生长初期（OD600=0.8-1.0）。
b.取10ml菌液加入约88μl NBD-PC，振荡培养20min左右加入FM4-64继续培养约25min。
c.收集菌体后在4ml含NaN3的SD-ura培养基中洗涤2次。
d.用激光共聚焦显微镜观察荧光。
1.2.4 拟南芥的培育及目的基因在拟南芥中基因功能验证
(1) 浸花法侵染。
将转入重组质粒（GmYbt1-A-1300，GmYbt1-A-1300GFP，GmYbt1-B-1300，和GmYbt1-B-1300GFP）的农杆菌接入YEP液体培养基中，在28℃摇床中培育，12000×g离心收集菌体，用配置的侵染液（1/2 MS液体培养基中加入5%蔗糖）重悬使其OD600值在0.6-0.8之间，加入SILWETL-77表面活性剂，对拟南芥幼苗盛开的花进行侵染。侵染所用的拟南芥幼苗为野生型哥伦比亚0型。侵染的频率为两天侵染一次，直至不再有新的花长出。等苗成熟后，收获F1代种子。
(2) F1代种子进行筛选。
将F1代种子种植在终浓度为25 mg/L潮霉素（Hyg）的MS固体培养基上进行筛选，并且统计性状分离比（长根数量：短根数量），挑选性状分离比接近3:1的株系进行土培，收获F2代种子。