大丽轮枝菌侵染不同棉花品种激发棉花的防御反应研究(2)
2.6防御酶活性7
3讨论与结论9
3.1 讨论9
3.2 结论10
致谢10
参考文献11
大丽轮枝菌侵染不同棉花品种激发棉花的防御反应研究
引言
棉花作为一种纤文作物和油料作物使棉花是世界上最重要的经济作物之一，生育期长，不仅易受环境因素影响，还很容易受到各种病虫害侵染（Zhang et al., 2013）。棉花黄萎病于1914年在美国被首次发现，20世纪末，棉花黄萎病在中国各大棉区开始蔓延，病害严重时可使棉田减产50%左右导致严重经济损失，是当今棉花生产的重要病害之一（石磊岩，1995）。棉花黄萎病是一种由大丽轮枝菌入侵而引起的土传真菌文管束系统病害（马远莉，1990）。作为一种土传性病害，大丽轮枝菌以孢子、菌丝和微菌核的形态存在于植株上或者土壤中，在遇到逆境时，病原菌能够以微菌核的状态存在于土壤中很长时间，当遇到适宜环境和寄主植物时病原菌开始萌发，形成菌丝或者芽管与寄主的根系表皮细胞接触，在根系表面菌丝体集合形成菌丝束，侵入寄主皮层的少数菌丝可以继续侵入文管束（赵凤轩,2009）。有研究表明大丽轮枝菌进入文管束后的菌丝将形成芽管沿植株导管壁的缘纹孔向相邻导管扩散到植株顶部，随着孢子体向植株顶部蔓延，病原菌逐渐侵入植株的叶片和茎部，叶片的通导率逐渐下降，水分运输受到阻碍，营养物质的输运也受阻，植株叶片开始变黄、萎蔫，植株组织坏死，表现黄萎病病症（戴小枫，2006）。也有研究发现，大丽轮枝菌能够侵染抗感病寄主，但侵染感病棉种速率要远远快于抗病棉种，抗病棉种具有生理生化抗性和组织结构抗性（肖红利，2014）。目前还没有针对黄萎病有效的防治方法，因此黄萎病是棉花的世界难题。研究黄萎病病原菌致病机理、棉花的与病原菌互作引发的防御反应，明确其抗病机制，对棉花黄萎病抗性研究有重要意义。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 供试材料与菌株
实验棉花品种为中植棉2号、中棉所41号、鲁棉研21号、鲁棉研28号、冀棉11号与苏棉9号，由实验室自留种保存。
实验菌株是通过根癌农杆菌转化法将绿色荧光蛋白基因GFP转入V1070菌系中获得具有绿色荧光标记的大丽轮枝菌中等致病力菌系V1070-2，菌系由南京农业大学棉花功能基因组实验室提供，其致病力与野生菌系致病力一致（胡慧兰, 2012）。
1．1．2 实验仪器
体式显微镜（Olympus MVX10）；荧光显微镜（Leica DM2500）；酶标仪（Tecan）；离心机（TG16-WS）。
1．1．3 实验试剂
苯胺蓝；间苯三酚；邻苯二酚；L-苯丙氨酸。
1．2 实验方法
1．2．1 培养棉苗
棉种预处理：选取健壮的棉种，进行60℃恒温水浴处理10min，70%酒精处理30s来消毒杀菌，然后用无菌水冲洗至少3次，最后后将种子转移到盛有适量无菌水的培养皿中，置于25℃恒温培养箱中培养1-2天。
营养土处理：在灭菌锅中对营养土进行121℃高温高压灭菌2h。
棉种种植：将预处理过后的棉种转移到无菌的营养土中，置于培养箱中培养（光周期14h,温度25℃左右），适量浇水，保持土壤合适湿度。
棉苗培养方法参考胡惠兰（胡慧兰, 2012）
1．2．2 大丽轮枝菌孢子悬浮液制备
将带有绿色荧光蛋白标记的大丽轮枝菌菌系V1070-2菌块接种于马铃薯葡萄糖（PDA）培养液中，在25℃、150转/分钟的转速下震荡培养4-5天，然后使用6层灭菌纱布过滤洗脱菌液获得孢子体，使用血球板来计算孢子数，用无菌水稀释到4×106cfu/mL（菌落数）。大丽轮枝菌大丽轮枝菌孢子悬浮液制备方法参考胡惠兰（胡慧兰, 2012）