摘要：建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）和齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）在杭州地区花卉市场的蝴蝶兰等兰科植物中广泛存在，严重影响其观赏价值及经济价值。兰科植物是多年生重要经济作物，其培育周期较长，外植体生长缓慢，但病毒病危害严重防治困难。抗病品种培育周期长且抗病性能不稳定；多年生植物转基因抗病品种培育，其外植体离体培养周期长是重要瓶颈。一旦发生兰花病毒病，会造成严重的经济损失，所以对于兰花病毒的研究具有重要的科研及经济价值。72136

由于兰科植物生产周期长，生长成本高，而本氏烟作为模式生物生长周期和成本都较低，所以为了研究建兰花叶病毒(CymMV) 和齿兰环斑病毒(ORSV)的致病机理，需要在已构建的抗上述两种病毒的本氏烟上进行抗病毒实验。

本实验从染病兰花植株体内提取RNA，经过扩增获得目的基因，再将目的基因导入pCAMBIA2300植物双元表达载体，构建了CymMV/ORSV杭州分离物病毒全基因组侵染性克隆：pCAMBIA2300-CymMV FL和pCAMBIA2300-ORSV FL。再通过农杆菌介导来完成CymMV/ORSV侵染本氏烟。 

毕业论文关键词：建兰花叶病毒齿；齿兰环斑病毒；本氏烟；侵染性克隆

Abstract：Cymbidium mosaic virus(CymMV) and Odontoglossum ringspot virus  (ORSV) is the two most common virus in orchids, seriously affect the value of orchid plants。

  Due to the long production cycle of Orchidaceae plants, we select Nicotiana benthamiana as a model experimental plant to study the pathogenic mechanism of CymMV/ORSV, and target to achieve antiviral transgenic Nicotiana benthamiana。

  In this experiment, RNA was extracted from virus infected orchid plants, full-length CDNA of CymMV/ORSV were obtained and analyzed。 We designed specific primers for constructing infectious clones of CymMV/ORSV Hangzhou isolate。 full-length sequences were inserted into plant binary expression vector pCAMBIA2300, and named as pCAMBIA2300-CymMV FL and pCAMBIA2300-ORSV FL, 

Keyword:  Cymbidium mosaic virus； Odontoglossum ringspot virus； Nicotiana benthamiana ;Infectious clone

目录

第一章 建兰花叶病毒（CymMV）侵染性克隆的载体构建 7

一、材料与方法 8

1。 植物材料 8

2。 质粒载体材料 8

3。 分子生物学试剂 8

4。 pCAMBIA2300-CymMV FL侵染性克隆技术路线图 9

5。 建兰花叶病毒侵染性克隆构建所需的引物 9

6。 染病兰花RNA提取及cDNA合成 10

7。 通过RT-PCR反应，获取病毒的CDNA 10

9。 对获得的病毒全长PCR产物进行纯化 11

10。纯化后病毒全长PCR产物插入片段的及表达载体的酶切处理 12

11。酶切后插入片段的及表达载体回收纯化 12

12。载体与目的基因片段的连接反应 13

13。链接产物通过热击法转化大肠杆菌感受态细胞 13

14。通过菌落PCR法鉴定插入病毒全长片段的阳性克隆