由于兰科是多年生植物，并且离体再生频率低，周期长，给抗病毒机理研究和抗病育种工作带来非常艰巨的困难。有研究通过摩擦接种的方法在本氏烟叶片上接种CymMV和ORSV病毒，植株表现出明显的病症[7] 。

病毒的扩繁、提纯和保持活性对于病毒基因组功能以及致病性研究是重要的基础环节，但是野生型病毒的复制能力不能保持稳定，在自然环境下还因易发生同源重组而产生变异。而构建病毒的侵染性克隆就可以有效解决上述问题。

病毒的侵染性克隆，是指人工获得的具有侵染活性的病毒体外转录RNA或者是具有转录活性的病毒cDNA或DNA，一般都可以通过细菌质粒来进行大量复制，并可通过现代分子生物技术进行基因的突变、插入，实现表达基因的编辑。病毒侵染性克隆是研究病毒功能及植物互做的基本技术平台，该技术的广泛应用推动了病毒学，病理学，遗传学的研究。

侵染性克隆可以用来分析植物病害的病原物种类和分布，鉴定我们克隆得到的病毒基因组是否为田间产生病害的相同病原物, 利用侵染性克隆还可以测试该病毒病原物的寄主范围。由于侵染性克隆源于原核质粒载体，通过现代分子操作手段可以对其进行基因的插入突变、置换突变、基因敲除等操作，通过构建一系列稳定表达的病毒突变体和重组体的侵染性克隆，可以明确相关致病基因的功能及致病因子的关键功能域或关键氨基酸位点

已有研究通过利用TMV的运动蛋白部分基因和CMV的复制酵蛋白部分基因构建了能够表达发卡形RNA的反向重复结构重组载体,并用农杆菌介导的转基因技术得到了具有稳定性的转基因烟草植株[8,9]。本实验室已将ORSV与CymMV的CP基因的部分反向重复序列分别插入植物表达载体pXGY1，构建了两种兰花病毒的沉默载体（pXGY1-ORSV,  pXGY1-CymMV）。并在兰花上进行了转基因植物构建，为下一步研究抗CymMV /ORSV奠定了工作基础[10]。

本研究基于农杆菌介导的植物双元表达载体尝试构建两种病毒的侵染性克隆，建立一个基本的但却是至关重要的技术平台。为从更深层次研究病毒致病机理提供了有效的工具，另外侵染性克隆的构建也在研究病毒介导的基因沉默，以及这两种病毒的基因功能，培育新型抗病毒兰科品种和植物反应器等方面也具有积极的研究意义文献综述。

第一章 建兰花叶病毒（CymMV）侵染性克隆的载体构建

引言

侵染性克隆是指具有侵染能力的病毒DNA或cDNA，以及它们具有侵染效力的体外转录产物。侵染性克隆技术的出现与推广，推动了病毒学以及病毒研究相关工作的发展前进。

为了使插入载体的克隆序列高效表达，通常的改进措施是在插入片段的上游载体中插入启动子。目前，使用最广泛的侵染性克隆构建策略：1）构建具有侵染性的cDNA或DNA克隆载体，通常选用花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）35S启动子；2）构建具有侵染效力的体外转录产物，需要加入T7、SP6等启动原核表达的启动子。

为了进一步研究CymMV的致病性，本章尝试构建建兰花叶病毒杭州分离物的侵染性克隆。

一、 材料与方法

1。 植物材料

野生型本氏烟（Nicotiana benthamiana）；毒源染病毒蝴蝶兰植株来自于杭州市传化大地生物技术有限公司花卉基地。

野生型本氏烟以及带毒蝴蝶兰植株均种于16小时光照/8小时黑暗循环的27 ℃恒温温室中。其中带毒蝴蝶兰植株隔离于纱网箱中，避免发生粉虱、蚜虫等昆虫叮咬后传播病毒。