水稻细菌性条斑病菌三个Xop基因功能研究相关载体的构建(2)
1 材料与方法
1.1PCR扩增目的条带
扩增片段1：
240 xopAF pro -u（EcoRI）gaattcCGCCAGCTTCGCATCCA
241 xopAF pro -d（ApaI）gggcccGTGAGTCATTCATTGCCCAGT
240+241扩增片段大小：453bp
用途：扩增xopAF启动子，后反向连接到pHM1 lacZ 启动子下，消除pHM1 lacZ启动子的影响，xopAF启动子融合eGFP 和cya 表达，观察xopAF启动子是否受到植物诱导表达
扩增片段2：
242 xopAF pro- u（HindIII）aagcttCGCCAGCTTCGCATCCA
243 xopAF pro- d（NcoI）ccatggGTGAGTCATTCATTGCCCAGT
242+243扩增片段大小：453bp
用途：扩增xopAF启动子，后直接连接到1300NG载体，xopAF启动子融合gusA表达，瞬时转化烟草，观察xopAF启动子在植物中被诱导表达
扩增片段3：
244 xopAF pro+CDS-u(ApaI）gggcccCGCCAGCTTCGCATCCA
245 xopAF pro+CDS+flag-d(BglII)agatct TTA TCA CTT ATC GTC GTC ATC CT TGTA ATC ATCGCGGAGCTGCTCCGTA
244+245扩增片段大小1.3kb
用途：扩增xopAF启动子+编码区+两个FLAG标签，连接到PHM1，转入xopAF突变体，用于利用FALG标签western测定xopAF启动子及其蛋白在不同的培养条件下的诱导表达
扩增片段4：
342xopAF pro+CDS-d (BglII)agatctATCGCGGAGCTGCTCCGTA
用途：244+342扩增xopAF启动子+编码区去掉终止密码子，便于同GFP,CYA做融合表达，检测蛋白分泌到植物细胞以及在植物细胞中的定位
扩增片段5：
246 xopAK pro-u（EcoRI）gaattcTCGGAAGACTGCCGGAGA
247 xopAK pro-d（ApaI）gggccc GGAGTCAGAACCGCCCG
246+247扩增片段大小：467 bp
用途：扩增xopAK启动子，反向连接到pHM1 lacZ 启动子下，消除pHM1 lacZ启动子的影响，xopAF启动子融合eGFP 和cya 表达，观察xopAF启动子是否受到植物诱导表达
扩增片段6：
248 xopAK pro-u（HindIII）aagcttTCGGAAGACTGCCGGAGA
249 xopAK pro-d（NcoI）ccatggGGAGTCAGAACCGCCCG
248+249扩增片段大小：467 bp
用途：扩增xopAK启动子，直接连接到1300NG载体，xopAK启动子融合gusA表达，瞬时转化烟草，观察xopAF启动子在植物中被诱导表达
扩增片段7：
250 xopAk pro+CDS-u（ApaI）gggccc CGGAAGACTGCCGGA250
251xopAk pro+CDS+flag-d(BglII)agatctTTATCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC CCACGACTTGTAGTAATAGAT
250+251扩增片段大小：1.25kb
用途：扩增xopAF启动子+编码区+两个FLAG标签，连接到PHM1，转入xopAF突变体，用于利用FALG标签western测定xopAF启动子及其蛋白在不同的培养条件下的诱导表达
扩增片段8：
343xopAk pro+CDS-d(BglII)agatctCCACGACTTGTAGTAATAGAT
用途：250+343去掉终止密码子，便于同GFP,CYA做融合表达
扩增xopAK启动子+编码区去掉终止密码子，便于同GFP,CYA做融合表达，检测蛋白分泌到植物细胞以及在植物细胞中的定位
扩增片段9：
252 Cya-u (ApaI) gggcccATGCAGCAATCGCATCAGG
253 Cya-d(BglII)agatctCTGGCGTTCCACTGCG
252+253扩增片段大小：1.2 kb
用途：扩增Cya编码区
扩增片段10：
266 GFP+-u(ApaI) gggcccATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACT
267 GFP+-d (BglII) agatctTTATTTGTAGAGCTCATCCATGCC
252+253扩增片段大小：720bp
用途：扩增GFP编码区
扩增片段11：
259 XopAF orf-(SacI) gagctcATGGTGCCTGTTACCTACTATCAGAAAGC
462 XopAF orf-R(SalI) gtcgacTTATCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCATCGCGGAGCTGCTCCGTA
259+462扩增片段大小：684bp
用途：扩增 XopAF编码区+flag，连接到载体P2300-d35S，编码区在双35S 启动子下超表达，注释烟草，用于通过OCTET(生物膜干涉检测)或Co-IP方法筛选互作蛋白
扩增片段12：
261 XopAK orf-F(SacI) gagctcATGAAGCCGGCTTGCATCA