近年来的研究表明,根围促生细菌蜡质芽孢杆菌AR156诱导植物产生的抗病免疫反应和flg22诱导的植物的病原物相关分子模式触发的免疫反应(PAMP-triggered immunity, PTI)有很多相似的地方[2]。目前对于flg22诱导植物产生抗病性极其分子机制研究已经较为深入,因此我们将就AR156是否能诱导植物产生和flg22相似的PTI反应进行实验,并对AR156诱导植物产生抗病性的分子机制,即AR156诱导植物产生抗病性是否依赖于茉莉酸(jasmonic acid, JA)、乙烯(ethylene, ET)以及水杨酸(salicylic acid, SA)通路进行进一步的探究。
1  材料与方法
1.1  材料
1.1.1  供试植物培养
供试拟南芥(Arabidopsis thaliana)的品种为“Col-0 WT、以及jar1、etr1、ein2、sid2-2、nprl、NahG”。首先将拟南芥种子均匀播种于育苗盘中,置于4 ℃春化处理3-5 d后,转移到22 ℃,光周期为光照10 h,黑暗14 h,相对湿度为40%-60%的温室中进行培育。待拟南芥苗长到2-3片真叶时(7d左右)进行移栽,移栽前在盆内放三分之一盆营养土后,加入蛭石覆盖满盆后以营养水浸透,移栽时每盆移栽3棵拟南芥幼苗,之后于同样条件的温室中继续培育四周。
1.1.2  供试菌剂培养
所用生防菌为蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)AR156。该菌株于-70 ℃冰箱保存,使用前在LB培养基上划线,28℃培养24 h。挑选长出的单一菌株转接到2 ml LB培养液中,28℃,200 r•min-1培养24 h成初培菌液,然后以1:1000比率接种到20 ml LB培养液中,28 ℃,200 r•min-1扩繁24 h,所得菌液于室温6000 rpm离心10 min收集菌体,再用灭过菌的超纯水重悬调整浓度至5.0×107 cfu•ml-1备用。
1.1.3抗生素和K.B培养基配制
a.抗生素利福平的配制:将利福平溶解在水中,配制成50 mg•ml-1的利福平母液,配制好的母液在超净台上用细菌过滤器过滤,分装后置于-20 ℃冷藏箱中备用。使用时按1:1000的比例稀释成50 mg•l-1即可。
b.抗生素卡那霉素的配制:将卡那霉素溶解在DMSO中,配制成50 mg•ml-1的卡那霉素母液,配制好的母液在超净台上用细菌过滤器过滤,分装后置于-20 ℃冷藏箱中备用。使用时按1:1000的比例稀释成50 mg•l-1即可。
c.K.B培养基(1 L)的配制:蛋白胨:20 g,甘油:10 mL,K2HP04: 1.5 g,MgSO4: 5 ml(1 M•L-1,无菌),用KOH调节PH至7.0,琼脂粉:15 g。注:MgSO4需于培养基灭菌后加,灭菌前加会导致培养基变浑浊。
1.1.4  供试病原菌的处理
供试病原菌为丁香假单胞菌番茄致病变种Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,在28 ℃条件下置于含有50 mg•L-1利福平和卡那霉素的K.B板上生长过夜,之后通过离心沉淀细菌细胞,并将其重悬于10 mM Mgcl2中,定容至5.0×105 cfu•ml-1备用[3]。
1.2  方法
1.2.1  AR156和flg22一样能诱导植物产生抗病性验证
选取生长了4周的拟南芥(品种为Col-0 WT),取每株拟南芥上3片叶龄、长势一致的叶片做好标记。分3组处理,即用5.0×107 cfu•ml-1 AR156,1μM flg22, 无菌水(对照)分别注射拟南芥叶片。24 h后在处理过的拟南芥叶片上注射浓度为5.0×105 cfu•ml-1的丁香假单孢菌番茄致病变种Pst DC3000;接种后用保鲜膜覆盖保湿12 h,揭去保鲜膜,置于22 ℃,光周期为光照10 h,黑暗14 h,相对湿度为40%-60%的温室继续培养,当植株叶片出现差异性发病表型时,对发病叶片进行取样拍照,并观察比较植株叶片发病表型差异。
接种病原菌Pst DC3000培养48 h后,对植株叶片取样进行致病性测定。取样前用75%的无水乙醇反复擦洗预取样的叶片两到三次进行消毒处理,然后取直径相同的打孔器截取叶片,每个截取的叶片样品分别放入一个EP管中,加10 mM Mgcl2研磨,之后吸取50 μL振荡液进行梯度稀释(吸取前将振荡液摇匀),梯度稀释后将其涂布在K.B培养基中(为确保实验准确度每个处理设置10个平行处理)。在28 ℃培养箱中培养48 h。48 h后统计K.B板上的菌落数,统计分析数据。     
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