引言
环状 RNA[1](是一种特殊的内源性非编码 RNA( noncoding RNA ncRNA) ,是继微小RNA ( microRNA,miRNA)及 长 链 非 编 码RNA( long noncoding RNA,lncRNA) 后的RNA家族又一研究新热点。Sanger[2] 等在 20 世纪 70 年代发现某些高等植物中存在可致病的单链环状类病毒,这是人类首次发现 circRNA。随后人们陆续在酵母线粒体、丁型肝炎病毒中发现 circRNA,也发现在小鼠的睾丸内含有性别决定基因( sex-determining region Y,Sry)转录而来的 circRNA,还证实了circRNA 也存在于人体细胞。虽然发现的很早,但在过去的几十年里,circRNA的研究却始终进展缓慢。
随着高通量测序及生物信息学的快速发展,越来越多的 circRNA 在生物体中被发现,它们并非偶然存在,也并非对基因表达毫无作用。它们广泛的,多样化的,保守的,稳定的存在于真核生物中,丰富了RNA家族的内容。利用 RNA 测序( RNAsequen-cing,RNA-seq) 原理,发现 circRNA广泛存在于古生菌中,并且可能具有未知的生物学功能,circRNA在人类细胞的基因表达程序中是普遍存在的,并以一种非经典的剪接形式产生。
    证明了 circRNA普遍存在后,研究人员又把目光投向 circRNA的产生机制和功能上。Salaman[2]等的研究表明,数以百计的人类基因可以转录形成circRNA;Jeck等人在人类成纤文细胞中检测到了25000多种的circRNA;Menczak等通过结合RNA-seq数据和人类白细胞数据库,鉴定出1950种人类circRNA、1903种小鼠circRNA(其中81种与人类circRNA相同)和724种线虫circRNA;近几年,研究者在植物中也发现circRNA的存在。
本实验通过在拟南芥中有效的农杆菌介导转化途径[3] ,构建circRNA4235和circRNA4595的突变体和过表达植株,运用PCR技术、酶切技术、转化、胶回收等实验方法,来研究circRNA在拟南芥中的生理作用。
1.材料
1.1植物材料
本实验的模式植物为拟南芥(Arabidopsis thaliana),哥伦比亚野生型(Col.Columbia),由实验室王琳师姐提供,具有其它植物无法取代的优点:生长周期短,基因组小,染色体少,具有双子叶植物的所有特性。
1.2实验仪器
  (1)PCR 仪:杭州博日科技有限公司;
  (2)恒温摇床:上海智诚分析仪器制造有限公司;
(3)超净工作台:苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;
(4)37℃培养箱 :上海一恒科学仪器有限公司;
(5)28℃培养箱 :上海跃进医疗器械有限公司;
(6)电热恒温水浴锅 :上海精宏实验设备有限公司;
(7) 漩涡震荡仪       (8)高压灭菌锅       (9)微波炉     (10)电子天平
  (11)凝胶成相仪器     (12)超速离心机      (13)电泳仪等
1.3载体与菌株
  中间载体pENTR,最终载体pEG202、大肠杆菌菌株JM109、农杆菌菌株GV3101等均为本实验室王琳师姐提供。
1.4主要试剂
T4 DNA连接酶、 Taq 酶、DNA限制性内切酶、LR酶、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、Clean-up 试剂盒、质粒提取试剂盒均有实验室提供。
1.5实验所用培养基
1.5.1 LB培养基(1L)如表1
 表1 LB培养基(1L)体系
LB培养基1 L
多聚蛋白胨    10 g
酵母提取物    5 g
氯化钠    10 g
琼脂粉    20 g
加蒸馏水溶解后定容至1 L
   固体LB培养基需要加1-2%琼脂粉。定量称取上述物质于烧杯中,加超纯水至1000 ml, 120℃高压灭菌20 min。
1.5.2培养基所用抗生素
本研究所涉及大肠杆菌菌株JM109培养基所用的抗生素为卡那霉素(kanamycin)。涉及农杆菌菌株GV3101培养基所用的抗生素为RGK。R:利福平,G:庆大霉素(王琳师姐提供),K:卡那霉素。
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