构建circRNA4235和circRNA4595转基因植物(3)
卡那霉素（kan）(50mg/ml)的)配制：
(1)溶解500mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。
(2)分装成小份于-20℃储存。常以10ug/ml-50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
利福平（50 mg/ml）配制50ml：
(1)称取2.5g 利福平置于50ml塑料离心管中。
(2)加入40mlDMSO，振荡充分混合溶解之后定容50ml，可以涡旋。
(3)用0.45um的细菌过滤器过滤，分装（1ml每管），置于-20℃储存。
2.实验方法
2.1植物材料培养
拟南芥在植物培养室培养，培养条件设置为：光照 10h，温度22℃，空气相对湿度 75％ ； 黑暗 14h，温度 22℃，空气相对湿度 75%。
2.2构建含有目的基因载体
2.2.1设计和合成引物
本实验使用Primer Premier软件，分别构建circRNA4235和circRNA4595基因过表达和突变型的上游和下游片段引物，由金斯瑞生物科技公司进行合成。
2.2.2拟南芥cDNA的获得[4]（突变体）
2.2.2.1拟南芥总RNA的提取：
操作步骤：
(1)取0.1g4周的拟南芥叶片，在液氮中充分研磨后，加入1mlTrizol，使其充分裂解。可放置4℃ 冰箱；
(2)12,000rpm 离心10min，弃沉淀；
(3)按200ul氯仿，振荡混匀后室温放置5min；
(4)4℃ 12,000rpm离心15min；
(5)吸取上层水相500ul，至另一DEPC处理过的离心管中；
(6)加入等体积水相的异丙醇，加入3M醋酸钠50ul,放置-20℃冰箱中过夜沉淀；
(7)4℃ 12,000g离心20min，弃上清；
(8)按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
(9)4℃ 8,000rpm离心5min，尽量弃上清。
(10)超净台中吹5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解；
(11)加30ul DEPC处理过的H2O；
(12)测RNA浓度。注：此方法提取RNA A260/A280值在1.8-2.0之间；
2.2.2.2反转录得到cDNA
用随机引物反转录得到cDNA，RNA浓度为1ug/ul,反转录体系为20ul.