蚂蟥组织单细胞制备的研究(2)
1 材料与方法
1．1 实验材料与仪器
材料 成龄蚂蟥经由南京农业大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）。
主要试剂 氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾（均为国产分析纯，南京寿德仪器试剂有限公司）；胰蛋白酶固体、牛血清蛋白固体（均购自北京索莱宝科技有限公司）。
仪器 FA1104分析天平（上海精密科学仪器有限公司）、HH-S型水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）、eppendorf台式离心机、生物显微镜（宁波舜宇光学有限公司）、血球计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）。
1．2 实验方法
1.2.1试验用溶液的配制
分别称取氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾和磷酸二氢钾，用双蒸水溶解定容，配制成不含钙镁离子的磷酸缓冲液（PBS），测其pH应在7.2-7.4之间。分别称取不等量的胰蛋白酶固体，用上述缓冲液溶解定容，配制成0.1%、0.2%、0.25%、0.3%和0.4%等不同浓度的胰蛋白酶溶液。称取牛血清蛋白固体，用缓冲液配制成浓度为1%的溶液（BAS）。
1.2.2样品制备
蚂蟥经10%乙醇麻醉后，解剖取出消化道组织和肌肉组织，在液氮中轻轻研磨至细小颗粒状，供酶解使用。
1.2.3胰酶浓度对细胞制备的影响
快速称取经液氮粉碎过的蚂蟥组织于离心管中；加入30倍组织量浓度分别为0.1%、0.2%、0.25%、0.3%、0.4%的胰蛋白酶溶液，在37℃条件下酶解10min，不时轻轻摇晃离心管以使酶液充分与组织接触；加入牛血清蛋白溶液终止酶解；100目滤网过滤；滤液低速（1000rpm,5min）离心；弃去上清液，加入1mlPBS悬浮；利用血球计数板在显微镜下对细胞进行计数。
1.2.4酶解时间对细胞制备的影响
快速称取经液氮粉碎过的蚂蟥组织于离心管中；加入30倍组织量的相同浓度胰蛋白酶溶液，在37℃条件下分别酶解5min、10min、20min、30min、60min，不时轻轻摇晃离心管以使酶液充分与组织接触；加入牛血清蛋白溶液终止酶解；100目滤网过滤；滤液低速（1000rpm,5min）离心；弃去上清液，加入1mlPBS悬浮；利用血球计数板在显微镜下对细胞进行计数。