利用土壤宏基因组文库鉴定微生物抗MAs(III)的分子机制(2)
目前研究土壤微生物的传统方法主要依赖于纯培养微生物的获得，然而已分离的可培养微生物的数量却依然十分有限，这大大限制了该类型方法的应用。宏基因组文库是指一种以环境中的微生物群落为研究对象，以现代基因组技术为研究手段，来研究微生物生理生化特性以及与环境之间关系的微生物新型研究方法[11,12]。简单的说，宏基因组文库是直接研究环境中微生物的DNA，只是从原来研究单个微生物的基因转变为研究整个环境中所有微生物的基因。相对于传统方法，宏基因组文库的优点在于，可避开传统微生物分离培养的过程，直接从DNA水平对环境中那些不可培养的微生物进行研究，从而获取更多有价值的遗传信息。
目前利用这种方法来获取环境中目的基因的技术已经十分成熟。本研究以一份具有砷甲基能力的稻田土壤为实验材料，提取其总DNA来构建宏基因组文库，通过后期的筛选鉴定到一种微生物抗MAs(III)的机制，并研究了该机制背后可能的分子生物学依据。 本研究为今后使用该类方法鉴定环境中MAs(III)的抗性机制打下一个坚实的基础。
1 材料与方法
1．1 试剂、菌株及培养基
MAs(V)购于南京生利德生物科技有限公司；MAs(III)的合成方法如下：称取Na2S2O3 4.2690 g/L，Na2S2O5 12.5473 g/L，用超纯水溶解后先加MAs(V)至终浓度0.2 mM，后加浓H2SO4至终浓度82 mM，最后用超纯水定容。其他实验用化学试剂均是通过商用途径购买的。构建文库所用的E. coli菌株DH5α购于北京全式金生物有限公司；MAs(III)抗性实验对照菌株用DH5α（pUC19）。实验用培养基的配方如下：LB培养基（g/L）：蛋白胨 10.0，酵母粉 5.0，NaCl 10.0；SOB培养基（g/L）：蛋白胨 20.0，酵母粉 5.0，NaCl 0.5，KCl 0.186，使用前加入灭菌的MgCl2至终浓度10 mM；ST10-1培养基（g/L）：蛋白胨 0.5，酵母粉 0.05，葡萄糖 5；配置固体培养基时需加入1.8%（g/v）琼脂粉。
1．2 土壤总砷含量的测定及孔隙水中砷形态的变化
1．2．1 土壤总砷含量的测定 称取0.25 g自然风干且过100目筛的信阳土壤，将其倒入消煮管中，按顺序对各消煮管进行编号，向消煮管中加入4 mL浓盐酸和1 mL的浓硝酸（王水），混匀，置于石墨炉中进行消煮，消煮程序如下（表1）：先按程序1进行消煮，此程序完成后隔夜，向消煮管中加入5 mL 20%的硝酸（优级纯），再按程序2进行消煮。整个消煮过程结束后，样品经0.22 µm的水相滤膜（广州洁特生物过滤股份有限公司）过滤，置于-20 oC的冰箱保存待测。
表1 土壤消煮程序
程序1
消煮阶段 升温速率（oC/min） 每阶段最终温度（oC） 每阶段文持时间（h）
1 1 35 3
2 1 60 3
3 2 105 1
4 2 125 2
5 off 0 0
程序2
消煮阶段 升温速率（oC/min） 每阶段最终温度（oC） 每阶段文持时间（h）
1 2 80 0.5
2 off 0 0
1．2．2 土壤的淹水培养及孔隙水中砷形态变化的测定 土壤淹水培养方法：将500 g过10目筛的风干土壤置于特定的容器中，向容器中加入超纯水到距离土壤界面3 cm处，静置；待水浸没土壤至液面稳定后，将毛细管取样器浸没于土壤样品中。将所有盛土容器转移到25 oC恒温条件下进行遮光培养。按照0、7、14、21、30 d的取样周期进行取样。