小麦赤霉病菌β2-微管蛋白E198A突变型对多菌灵的抗药性调控研究(2)
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参考文献： 12
小麦赤霉病菌β2-微管蛋白E198A突变型对多菌灵的抗药性调控研究
引言 小麦赤霉病是国内外威胁小麦生产安全的主要流行病害之一，它由多种镰孢菌引起，优势种为禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）。小麦赤霉病不但会导致小麦产量降低，其病原菌还会在病粒中分泌脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON毒素），造成对人和牲畜的毒害作用，严重威胁着食品安全和人类的健康[1]。对于小麦赤霉病的防治，选育抗病品种被认为是最有效且最经济的措施，但是由于目前尚未培育出对赤霉病完全免疫的抗病品种，生产上应用的品种多为中度抗性品种，缺乏对具有高抗的小麦种子资源。因此，在扬花期施用化学药剂仍然是防治该病的一项应急措施。自上世纪70年代以来，我国防治小麦赤霉病使用的主要药剂是以多菌灵为主的苯并咪唑类杀菌剂，但随着该类药剂使用频率的增大及使用年限的增加，小麦赤霉病菌已对多菌灵产生抗药性，且抗性范围逐年扩大，抗性比例逐年上升，从而导致赤霉病防效丧失，病害抗药性流行加剧。
南京农业大学杀菌剂生物学实验室通过多年的研究证实，小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性是由其β2-微管蛋白基因的密码子发生突变造成，目前已报道的位点包括6、50、165、167、198、200、241和257位[2]。南京农业大学周明国教授研究小组发现，禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因第E198K（第198位氨基酸突变Glu-Lys）位点突变可导致该菌对多菌灵高抗，第E198Q（第198位氨基酸突变Glu -Gln）位点突变可导致该菌对多菌灵低抗[3]，第E198L（第198位氨基酸突变Glu-Leu）位点突变可导致该菌对多菌灵高抗[4]。而在灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）对多菌灵的抗药性研究中发现，灰葡萄孢菌β-微管蛋白基因第E198A（第198位氨基酸突变Glu-Ala）位突变体对多菌灵表现高水平抗性[5]，于是我们大胆提出猜想，禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因第E198A位突变体是否也可以对多菌灵产生抗性。本文利用定点突变技术和同源置换法构造了禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因第E198A位突变体，通过测定E198A突变体对多菌灵的敏感性来确定该位点与抗药性的关系。
1 材料与方法
1.1供试菌株及试剂
1.1.1菌株
表1 本实验所用菌株
菌株 相关特性 来源
2021 野生型菌株，对多菌灵敏感 实验室保存
Δβ2-23
β2c-1 2021菌株β2-微管蛋白基因敲除体
Δβ2-23菌株β2-微管蛋白基因回复体 实验室保存
实验室保存
1.1.2 培养基
表2 本实验所用培养基
培养基 配方（1L） 用途
PDA 土豆（煮沸去渣）200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g 菌落培养
YEPD 蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母提取物3g 摇培菌丝
绿豆汤 30g绿豆（煮到绿豆微微开裂，然后过滤） 摇培孢子体
再生培养基 水解酪蛋白1g，酵母提取物1g，蔗糖1M，琼脂粉16g 筛选转化子
覆盖培养基 水解酪蛋白1g，酵母提取物1g，蔗糖1M，琼脂糖10g，
150μg/ml潮霉素B（使用前43℃时加入培养基） 筛选转化子
1.2 禾谷镰孢菌分子生物学操作方法
1.2.1禾谷镰孢菌基因组DNA提取（CTAB法）
（1）取冻干的菌丝约0.2g，在液氮中迅速研磨成粉末状；
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