耐有机相氧化亚铁硫杆菌的驯化及培养特性研究(4)
4、如此进行下去，就可获得对有机相具有较强耐性的驯化菌株。
5、 对照组：于100 mL锥形瓶中加入灭菌后的9 K培养基50 mL，用硫酸（5mol/L）调pH至2.0，待pH稳定后，接种体积分数为2％的未驯化的A．F菌，在30℃、振荡速度为120 r／min的条件下培养。随后定时取样用血球计数法测定T.F菌的菌数及用重铬酸钾滴定测亚铁离子的浓度。
6、定时取样用血球计数法测定T.F菌的菌数及用重铬酸钾滴定测亚铁离子的浓度。分别绘制时间-亚铁氧化率曲线，进行分析讨论。
2.3.5 T.F菌的培养特性研究
采用单因素实验研究实验室经过驯化的氧化亚铁硫杆菌的生长特性。通过测定培养过程中Fe2+浓度的变化，计算Fe2+氧化速率，研究初始pH值、初始接种量和温度对细茵生长的影响。培养液中Fe2+浓度用重铬酸钾法测定。
1.微生物生长条件
1．1 初始pH 对菌体生长的影响
量取菌液2mL接种到50mL的9K培养基中，分别调节酸度至pH为1.0，2.0和2.5，并将其置于30℃摇床中，在转速为120r／min的条件下进行培养，定时取样测定培养液中的菌体浓度和Fe2+氧化率，并对时间-Fe2+氧化率绘制曲线进行分析。
1.2 初始接种量对菌体生长的影响
接种量取为1%、5%、10%，分别接种到50mL的9K培养基中，调节酸度至pH=2.0，并将其置于30℃水浴摇床中，在转速为120r／min的条件下进行培养，定时取样测定培养液中的菌体浓度和Fe2+氧化率，并对时间-Fe2+氧化率绘制曲线进行分析。
1．3 温度对菌体生长的影响
量取菌液2%分别接种到50mL的9K培养基中，调节酸度至pH=2．0，并将其分别置于25℃，30℃，40℃水浴摇床中，在转速为120r／min的条件下进行培养，定时取样测定培养液中的菌体浓度和Fe2+氧化率，并对时间-Fe2+氧化率绘制曲线进行分析。
2.生长曲线的绘制
量取最适驯化后的菌的菌液量为2%，接种到9K培养基中（共50mL），调节酸度至pH=2.0，并将其置于30"C水浴摇床中，在转速为120r／min的条件下进行培养，定时取样测定培养液中的菌体浓度和Fe2+氧化率，并对时间-Fe2+氧化率绘制曲线进行分析。
3 结果与讨论
3.1 不同浓度有机相对 T.F菌的驯化研究
3.1．1 不同有机相浓度对T.F菌株生长影响研究
图3.1 初步1.5%、2.5%驯化和空白对照三组实验的菌株细胞数与时间的关系
如上图3.1所示： 1.5%、2.5%有机相的第一遍驯化培养和空白对照三组实验的菌株细胞数与时间的关系，在没经过驯化的T.F菌在1.5%有机相和2.5%有机相中的生长情况较空白组都不理想；虽然各自达到稳定期的时间大致相同但是细菌数却相差很多，1.5%和2.5%有机相中的菌数分别是对照组的63.6%和64%，可见有机相的存在是对T.F菌的生长情况有较显著影响的。
图3.2 有机相浓度对T.F菌Fe2+氧化率的影响
如上图3.2所示：图3.2分析知，2.5%有机相培养基中二价铁的氧化率较1.5%的低；若以二价铁氧化率1%以前为迟缓期，则2.5%有机相对T.F菌造成的迟缓期为28h，长于1.5%有机相对T.F菌造成的延缓期20h；所以有机相对T.F菌的生长有抑制作用且高浓度的有机相更不利于T.F菌的生长。所以对T.F菌的驯化可从低浓度开始，循序而渐进。这里的空白对照组的曲线可视为标准曲线，以后的驯化标准以此为准，当驯化曲线达到这个标准曲线的趋势（斜率），即可进行下一步驯化。
3.1.2 浓度为1.5%的有机相对T.F菌的驯化研究
图3.3 1.5%三遍驯化过程中的细胞数变化
如上图3.3所示：如图中曲线显示，开始细菌不适应，生长较慢，在达到稳定期时细菌数由第一遍到第三遍的数值分别为7.2×107、8.1×107、1.1×108；由细胞数可知，三次驯化培养T.F菌到达稳定期的时间相同，由此可断定低浓度有机相对细菌达到稳定期的时间影响不显著；第三遍的驯化曲线趋势已经和空白组的生长曲线靠近，可进行下一步转接驯化。
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