猪肉色相关候选基因TFRC的鉴定与组织表达模式分析(2)
Abstract . 1
Key words . 1
引言 .2
1 材料与方法3
1.1 试验材料3
1.1.1 试验样品3
1.1.2 试剂与耗材.3
1.1.3 器材与设备4
2 试验方案4
2．1 候选基因筛选.4
2．2 总 RNA的提取及 cDNA 的合成4
2．2．1 总 RNA提取. 4
2.2.2 cDNA 合成. 5
2．3 定量引物设计.5
2.4 候选基因 TFRC表达模式分析.6
2.5 数据分析.6
3 结果分析与讨论7
3.1 RNA提取结果. 7
3．2 反转录 cDNA 检测结果 8
3．3 引物检测结果分析8
3．4 不同肉色组织的表达量结果分析.9
3．5 不同组织的表达量结果分析.10
致谢.11
参考文献：.11
图 1 2
图 27
图 38
图 4 9
图 510
图 611
引言：有许多的技术指标，如肉色、系水力、肌肉脂肪含量、pH、嫩度等，都可用于评定肉品质量（简称肉质）[1]。但在实际消费中许多的技术指标并不被消费者直观认知，而肉色是消费者最容易认知的感观指标，肉色的好坏会直接影响着消费者的消费欲望，因此对生产者和消费者来说肉色是非常重要的肉质指标[2,3]。在肉色形成的机制中，血红蛋白、细胞色素 C 和肌红蛋白等都有影响。肌肉色素的主要成分是肌红蛋白（约占总量的 61%），尤其在宰杀时，若使动物充分失血，其含量可高达 80%-90%，因此，肌红蛋白是影响肉色的决定性蛋白[4]。肌红蛋白是一种可溶于水的蛋白，它有 8 个α-螺旋区，其间以短链非螺旋片段相连。肌红蛋白中有众多残基，其中，组氨酸尤为重要，因为它影响着肌红蛋白的结构和功能，因此被人们普遍重视。血红素存在于肌红蛋白的疏水腔中。每个血红素由四个吡咯亚基组成一个环，血红素环中央的亚铁离子可以形成 6 个键。其中 4 个键与吡咯的氮原子相连，第五个键与近端的组氨酸（histidine-93）结合。第优尔个键可以可逆性的与 H2O、O2、NO 等配体结合，与不同配体结合就显现出不同的肉色。末端的组氨酸（histidine-64）通过影响疏水腔中的空间结构，也对肉色的变化有影响。是否结合配体、所结合配体的种类和铁离子的化合价决定了肉色[5]。因此，肌红蛋白的四个主要的化学形态主导性的决定了肉色。其四种化学形式的转换如下图 1 所示。尽管如此，肉色形成的分子调控机制及相关通路仍不清楚。TFRC 基因即转铁蛋白受体基因（transferrin receptor gene），主要功能即调控转铁蛋白受体 TFR(transferrin receptor )的合成。TFR 是一种膜转移蛋白，由二硫化合物链接，其等电点为 5.2，分子质量约在 17000～20000 u。TFR 能与转铁蛋白TF(transferrin)互相作用后介导铁离子的吸收。在生理 PH 下，TFR 和 TF 的结合能力的大小顺序为：含两个的铁离子的 TF>含一个铁离子的TF>不含铁离子的 TF。 TFR 和含两个铁离子的TF 结合，进而被网格蛋白内吞、内化。PH下降使 TF 产生结构上的变化脱去铁离子。脱去了铁离子的 TF 和 TFR 的复合物出细胞，TF 与 TFR 分离，带有两个铁离子的 TF 和 TFR再次结合。在生理状态的 PH下，脱铁 TF 和 TFR 的结合能力远远小于含两个铁离子的TF（仅为1/10~1/100）。TFR 的内化与其他受体不同，它不是简单与配体结合，也不是连续的内化，而是通过与配体发生相互作用而内化。约有 10%的 TFR 会再次被利用，这一循环过程通过高尔基复合体完成[7]。可见，TFRC 基因通过调控转铁蛋白受体间接影响了动物体内铁离子的转运过程，而铁离子是血红素中重要组成部分，其价态的变化直接影响肉色变化。因此，可以推测出 TFRC基因可能与肉色相关。影响肉色的因素众多[8,9]。基因、日粮、糖酵解潜力、外部环境因素、微生物等因素均会对肉色产生影响。多年来，国内外开展了大量的研究用于肉色性状数量性状基因座QTL 的鉴定[10,11,12,13,14,15]，以及肉色性状候选基因的挖掘[16]。目前 QTL 数据库中(www.animalgenome.org)收入了 591 个与肉色相关的 QTLs。氟烷基因(Halothane, Hal)也名兰尼定受体基因 1 (RYR1)，它是猪肉质性状的主要影响基因，其 cDNA 的 1843 碱基处的 C/T 突变会引起其蛋白质受体结构和功能也发生改变， 在受到应激时会导致猪应激综合征 PSS(Porcine Stress Syndrom)，产生肉色苍白的 PSE 肉（Pale, Soft, Exudative）[17]。另外，PRKAG3 (Protein Kinase, AMP-Activated Gamma 3 Non-Catalytic Subunit)是肌糖原含量的主效影响基因（Rendement Napole, RN，酸肉基因），研究表明该基因可显著影响猪的肉色性状[18]。尽管如此，氟烷基因与酸肉基因的变异并不能充分解析肉色的表型变异。近年来，研究发现 NUDT7 ，EDN3 和 PHACTR3 [19]，以及 NR5A1 基因[20]与肉色存在密切的联系，但这些基因是否是影响肉色形成的关键基因仍需要更充分的证据加以证明。由此可见，目前有充足证据证明能影响肉色性状的关键基因数目非常有限，可用于肉色性状遗传改良的有效分子标记还十分匮乏。本研究在前期高通量转录组测序数据完成基础上，通过相关生物信息学分析与文献资料查阅，初步鉴定出影响猪肉色性状的关键候选基因 TFRC。在此基础上，使用Real-time PCR 技术对候选差异基因在不同肉色的骨骼组织中的表达差异进行验证，并对候选基因在各种组织中的表达模式进行检测，为深入开展肉色性状形成的分子调控机制研究以及 TRFC基因在分子育种中的应用奠定理论基础。
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