Rho1参与热胁迫调控灵芝三萜生物合成的初步研究 (2)
Rho1是一种GTP酶信号蛋白，Rho1GTP酶可以赋予生物必要的抗氧化剂，能够缓解因热胁迫导致的ROS的积累引起的损伤。有文献表明，小G蛋白在细胞信号传导过程中具有重要作用，参与调控真核细胞的生长、发育和次生代谢等生理过程[8]。当前的研究中已经发现，在灰霉病菌中， Rho3参与调控细胞生长、分生孢子形成以及菌株毒力[9]。烟草NtRop1(Rho1 of plant)转基因植株对盐胁迫的敏感性提高[10]。拟南芥At ROP11不仅参与调节种子萌发、幼苗生长、气孔关闭，而且还参与干旱胁迫应答过程[11]。大鼠烫伤和体外实验研究中发现，小G蛋白RhoB表达上调，并且RhoB的表达可以促进SGK（serum and glucocorticoid-regulated protein kinase）mRNA表达，从而使细胞减少因热胁迫造成的损伤 [12]。以上证据表明，Rho1可能参与调控灵芝菌丝的生长发育以及次级代谢。
热胁迫能够影响子囊菌的生长发育以及真菌体内的次生代谢。ROS在植物逆境胁迫中发挥重要作用，Rho1能够参与胁迫调控的ROS的变化。当前对于Rho1的研究主要集中于动植物领域，微生物的研究较少，尤其是丝状真菌。因此，在本研究中，我们研究了Rho1在热胁迫下对灵芝菌丝生长和灵芝三萜生物合成的影响，同时我们还检测了灵芝三萜合成过程中相关物质的变化，进一步加深对灵芝生长以及三萜合成的认识，以便进一步完善调控灵芝三萜生物合成的网络。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株及试剂
灵芝(Ganoderma lucidum HG)菌株由应用真菌实验室保存，同时保存于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号ACCC53264。其它化学试剂均为Sigma公司或国产分析纯。
1．1．2 菌株培养
CYM培养基(1L)：麦芽糖10g，葡萄糖20 g，蛋白胨2g， 酵母提取物2g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾4.6g，琼脂20 g(固体)。
灵芝菌种于4℃保存，菌株在CYM液体培养基(250 mL三角瓶装100 mL)中培养，150 rpm/min，28℃培养7 d。本实验中所有Rho4，Rho5菌株皆为Rho1的沉默菌株。
1．2 方法
1．2．1热胁迫处理方法
平板培养：灵芝菌株在CYM平板上正常培养3天，42℃热胁迫处理20min后，放回28℃恢复生长2天。检测胞内ROS以及ROS相关基因表达量时，将在CYM平板上正常生长5天的灵芝菌株42℃处理30 min，立即用ROS荧光探针DCFH-DA孵育或收集样品提取RNA。
液体发酵培养：250 mL锥形瓶中装100 mL CYM培养基，接种灵芝平板种，在摇床中以150 r/min转速，28℃培养7天，获得液体种子待用。液体灵芝种子经过无菌破碎，以3%的接种量转接到100 mL CYM液体培养基中，以150 r/min、28℃震荡培养5天，而后42℃热胁迫静置处理12 h，28℃静置恢复生长至第7天。收集锥形瓶内全部菌丝，用自来水冲洗干净，置于无纺布上，放入烘箱，60℃烘干至恒重，天平测量菌丝干重并按照方法测定总灵芝酸及其中间代谢产物的含量。
1．2．2三萜含量测定
(1)以灵芝三萜A为标准品绘制标准曲线。(2)三萜测定：菌丝处理后置于28℃摇床培养7 d，收集菌丝， 60℃烘干至恒重，研磨待测。样品制备：精密称取0.2g 60℃菌丝粉，定容至10 mL，加入95%乙醇定容，超声波破壁2 h，期间每20 min摇动一次，取8 mL37℃静置过夜，60℃旋转蒸干，加入0.5 mL甲醇溶解，溶解液置于1.5 mL离心管中，离心后，使用一次性0.22 µm有机相滤器过滤，通过UPLC (ultra-performance liquid chromatography)检测。
1．2．3灵芝总RNA的提取及cDNA制备
菌丝体的收集：灵芝菌株接种于CYM培养基上，28℃正常培养5天，菌落直径达到5 cm左右后，42℃热胁迫处理0 min-60 min，收集菌丝，液氮速冻保存待用。