花马池盐湖嗜盐细菌多样性研究(2)
高盐环境中较高的盐浓度会抑制绝大多数微生物的生长，但却适于嗜盐菌的生长 [1]。近几年来，人们不断地对我国盐场、盐湖、高盐土壤等地的嗜盐菌进行多样性研究，并发现了多种嗜盐菌新种[2]。根据细菌耐盐能力不同 ,可归为以下五类:耐盐菌（Halotolerant bacteria），极端嗜盐菌（Extreme halobacteria），中度嗜盐菌（Moderately halophilic bacterium ），弱嗜盐菌（Weak halophilic bacteria）和 非嗜盐菌。它们的最适生长盐浓度分别为:0.2 mol/l - 2.5 mol/l，2.5 mol/l - 5.2mol/l ，0.5 mol/l - 2.5 mol/l，0.2mol/l - 0.5mol/l和小于0.2 mol/l。其中，中度嗜盐菌对盐环境的适应能力较强[3，4]。
研究结果表明，嗜盐菌为了适应高盐环境，进化形成了独特的结构、功能及代谢机制，并能产生多种特殊的物质来影响周围环境，是研究细菌多样性特征的良好材料[5-7]，同时在多聚化合物的合成、食品、环境修复与能源利用、医药、生物电子学等领域中有着广泛的应用[8-10] 。目前，国内的科学家大多在西部地区的天然盐湖、盐碱湖等地研究嗜盐古菌的物种组成 [11-14]，而对高盐环境中的嗜盐细菌研究相对较少。花马池盐湖地处我国东部沿海地区，是陕西省最大的产盐基地，蕴含着丰富的原盐资源，适于嗜盐细菌的生长，为研究嗜盐细菌的多样性特征创造了有利的条件。因此，通过对花马池盐湖中嗜盐细菌多样性的研究，我们可以了解盐湖卤水环境的基本特点，充分利用天然盐湖资源、发挥嗜盐细菌的特殊功能，提高盐湖中原盐的质量和产量。
本研究主要基于嗜盐细菌的16S rRNA 基因序列的高度保守性和普遍存在性[15]，采用454高通量测序手段对提取的特定基因序列测序和优化，获得花马池卤水中嗜盐细菌多样性特征。之前，人们往往采用传统的培养方法来分析环境中微生物的种类及特征，而这种方法具有较大的局限性，不能获得样地中所有的微生物。本次实验采用454高通量测序方法能够弥补传统的培养方法的不足，获得环境中可培养、不可培养和未分类的微生物，提高了实验的准确度。到目前为止，454高通量测序方法已经运用于大量的研究[16-18]。沈婵娟[19]应用该技术研究了嗜水气单胞菌噬菌体的生物学特性及其基因组学，帮助人们预防和治疗噬菌体侵染引发的疾病；李建民[20]等应用该技术对活性污泥系统聚糖菌进行了富集并对菌群进行了多样性的分析，发现Tepidicella是该环境中的优势菌属；虞结梅[21]将该方法应用于粪便中病毒的发现与分析，可以让人们提高对潜在病毒病的警惕，养成良好的卫生习惯。因此，通过454高通量测序法研究花马池盐湖卤水嗜盐细菌群落组成和多样性特征，为充分挖掘与利用嗜盐细菌提供数据基础。
1 材料与方法
1.1实验材料
1.1.1样地概况
花马池，又名盐场堡湖，位于陕西省定边县盐场堡乡境内（107°30′15′′E， 37°41′20′′N）。 湖区在毛乌素沙漠南缘，气候干旱，年平均气温7°C，年降水量200毫米，年蒸发量达2800毫米，年日照时数2900小时。盐湖面积24km2，湖水面积3.3 km2。其中存在着许多的离子，主要有Na+、Mg2+、K+， Cl-、HC03-等等，其中，Na+、Cl- 在它们之中所占的比重较大。
1.1.2获取水样
于2014年12月采集花马池盐湖卤水水样，在4℃的冰箱中保存，为实验做准备。卤水采集过程中使用无菌离心管、无菌手套，采集过后，用过滤器过滤。
1.2具体实验流程
1.2.1宏基因组DNA提取
提取花马池盐湖卤水水样的宏基因组DNA（试剂盒：OMEGA公司E.Z.N.A.水体样品DNA试剂盒）。
1.2.2 宏基因电泳检测与分析