鲫鱼心源维隆气单胞菌的分离与鉴定(2)
为了系统地研究患病鲫鱼的心脏中是否有文隆气单胞菌（A.veronii），我们采用了形态学观察、生理生化试验及克隆16SrRNA并对其序列进行检测等分离鉴定方式对其鉴定，最后构建系统发育树。近年来，许多学者做过关于鲫鱼组织中文隆气单胞菌的分离鉴定，但是研究的组织大多在鲫鱼的肠道、鱼鳃、肝脏中，如夏飞【13】等的实验中做了关于患病鲫鱼肝脏中文隆气单胞菌对鲫鱼的感染实验，证明其有致病性。宋振辉等也从患病鲫鱼的肝脏中分离鉴定出文隆气单胞菌【3】。国内在鲫鱼心脏中文隆气单胞菌的研究目前寥寥无几，所以本实验在鲫鱼心脏中提取文隆气单胞菌并进行分离鉴定便有了一定的现实意义。
1 实验部分
1.1 材料
1.1.1实验动物
实验鲫鱼从徐州某菜市场购买，重约60±20g。
1.1.2 实验试剂及仪器
氯化钠、琼脂、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母提取物等均来自上海生工公司，TSA培养基、TSB培养基、LB培养基都是我们用以上原料自己动手制作完成。生理生化鉴定管，生理生化鉴定药品等来自杭州生物科技有限公司。MasterMix、双蒸水ddH2O、细菌基因组提取试剂盒来自大连某生化公司。主要仪器有PCR仪、离心机、凝胶成像系统等。
1.2 方法
1.2.1 菌种的分离纯化
参照黄文明【14】等的方法进行分离纯化，无菌操作取出发病鲫鱼病变的心脏组织，接种在TSA培养基上，29℃培养12-18h。挑取单菌落四区划线进行纯化，纯化的菌株放置于冰箱中4℃保存以备用。纯化的菌株接种在营养琼脂平板上，放于29℃温箱培养12-18h,观察菌种的形态并挑取单菌落进行革兰氏染色，我们用标准革兰氏染色试验步骤观察细菌的形态特征。
1.2.2菌种的保藏
首先进行摇菌，接着过夜处理，第二天放入离心机中以3000rpm转10min,接着去除上清，然后加80%浓度的甘油，盖上EP管盖，上下颠倒，使菌液与甘油充分混匀，最后放入-80℃冰箱保藏。
1.2.3 生理生化鉴定
将纯化的细菌分别接种于28支微量生化鉴定管中，在29℃的温箱中培养24小时，然后第二天观察该菌种的生理生化反应，对分离纯化的菌种进行鉴定。
1.2.4细菌基因组DNA的提取
按照标准的细菌基因组DNA提取的方法，用细菌基因组提取试剂盒对MX菌株的DNA进行提取，需要提取到纯度高、质量高的基因组DNA。为下一步PCR扩增作准备工作。
1.2.5PCR扩增
采用16SrRNA的通用引物，上游引物27F: 5’- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3’，16S rRNA的下游引物1492R: 5’- TACGGTTACCTTGTTACGACTT -3’,上下游引物均由上海某生物工程公司合成。DNA模板制备：整个的DNA由上一步细菌基因组DNA的提取制备。PCR反应体系：DNA模板10ul，上、下游引物（10umol/L）各4.5ul，MasterMix45ul,双蒸水ddH2O31.5ul
PCR扩增程序：
温度（Temperture） 时间（Time） 循环次数（Cycleindex）
95 ℃预变性 5 min 1 Cycle
95 ℃变性 45 s
30 Cycles
55 ℃退火 30 s
72 ℃延伸 1 min 30 s
72 ℃延伸 10 min 1 Cycle
1.2.6琼脂糖凝胶电泳
将提取到细菌基因组DNA稀释到我们所需的工作液之后，在琼脂糖凝胶上点样，加盖，设置一下电压为70 v，时间为30 min。电泳完之后用EB染色，染色约30min，接下来漂洗10min.最后用凝胶成像系统拍照。最后与DNA Marker比较，检测得到PCR扩增产物的长度。
1.2.7胶回收
按照标准胶回收的步骤来对PCR片段进行胶回收。
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