菌株SQR9野生型和突变体在不同IAA合成中间产物吲哚类物质中产IAA能力的探究(2)
2.1 吲哚衍生物的适宜添加浓度的探索 5
2.2 不同吲哚衍生物处理的SQR9和ΔysnE发酵液中IAA定量分析 7
2.3 不同吲哚衍生物处理的SQR9和ΔysnE发酵液中TOL和ILA定量分析 8
2.4 不同吲哚衍生物处理的SQR9和ΔysnE发酵液中TAM定量分析 10
2.5 不同吲哚衍生物处理的SQR9和ΔysnE发酵液中IAM和IAN定量分析 10
3 讨论 11
致谢 13
参考文献 16
菌株SQR9野生型和突变体在不同IAA合成中间产物吲哚类物质中产IAA能力的探究
引言：已有研究表明，有80%的根际微生物能够产生IAA(Khalid et al. 2005; Patten and Glick 1996)。由于微生物体内合成IAA是通过多种途径完成的，即使在模式微生物中，想要获得IAA合成完全缺陷型的的菌株也是非常困难(Spaepen et al. 2007a)。研究表明，在细菌中至少存在5种依赖色氨酸生物合成IAA的途径：吲哚丙酮酸(IPyA)途径、色胺(TAM)途径、吲哚乙酰胺(IAM)途径、吲哚乙腈(IAN)途径和色氨酸侧链氧化酶(TSO)途径。这些途径是微生物合成IAA最主要的途径(Duca et al. 2014; Spaepen et al. 2007a)。吲哚丙酮酸(IPA)途径是植物合成IAA最主要的途径，该途径中的限速关键基因ipdC催化吲哚丙酮酸转化为吲哚乙醛，该基因在A. brasilense、En. cloacae, P. putida和Pa. agglomerans等多种细菌中被鉴定到(Duca et al. 2014)。色胺(TAM)途径中的色氨酸脱羧酶和胺氧化酶在微生物中也被鉴定到(Hartmann et al. 1983; Perley and Stowe 1966)。吲哚乙酰胺(IAM)途径是在微生物中研究最清楚的途径，基因iaaM 和iaaH已经在革兰氏阴性菌中鉴定到(Kochar et al. 2011)。吲哚乙腈(IAN)途径现在研究的非常少，腈水解酶目前只在Alcaligenes faecalis鉴定到(Kobayashi et al. 1993)。然而目前，在IAA生物合成的关键基因或蛋白的鉴定和研究很少，都只是针对生物合成IAA一个途径特定的基因或蛋白质(Spaepen et al. 2007a)。
目前，在在革兰氏阳性菌中，IAA生物合成途径的研究非常少。Idris等在解淀粉芽孢杆菌FZB42中，通过全基因组分析得到三个可能参与色氨酸依赖型IAA合成的候选基因，三个基因敲除突变株中有两个突变株ΔysnE 和ΔyhcX的 IAA产量下降。yhcX为预测的腈水解酶，参与IAN途径；ysnE为预测的色氨酸酰基转移酶，参与一个未知途径(Idris et al. 2007)。
我们对SQR9和ΔysnE的发酵液进行HPLC分析，发现基因ysnE在SQR9生物合成IAA的途径中发挥重要作用；通过HPLC和LC-MS手段分析SQR9和ΔysnE的发酵液中差异性组分，猜测基因ysnE可能参与吲哚丙酮酸途径。为了研究基因ysnE参与生物合成IAA的何种途径，通过添加吲哚丙酮酸（IPA）途径、色胺（TAM）途径、吲哚乙腈（IAN）途径和吲哚乙酰胺（IAM）途径中关键的中间产物吲哚丙酮酸（IPA）、色胺（TAM）、吲哚乙腈（IAN）、吲哚乙酰胺（IAM）以及色醇（TOL）、吲哚乳酸（ILA）和色氨酸（TRP）等7种物质培养SQR9和ΔysnE，进而分析SQR9和ΔysnE的发酵液的IAA和这7种关键组分，从而寻找基因ysnE参与IAA合成的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株：解淀粉芽孢杆菌SQR9，由南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化利用高技术研究重点实验室分离鉴定和解淀粉芽孢杆菌SQR9的突变体ΔysnE。
改良Landy培养基：改良Landy培养基：葡萄糖 10 g，L-谷氨酸2.5 g，磷酸二氢钾1 g，七水合硫酸镁0.5 g，氯化钾 0.5 g，四水合硫酸锰 5 mg，七水合硫酸铜 0.16 mg，七水合硫酸亚铁 0.15 mg，L-苯丙氨酸 2 mg，蒸馏水定容至1L，pH 6.5，115℃灭菌30min。
试剂：乙酸乙酯、色谱级甲醇、冰醋酸（分析纯）、L-色氨酸、超纯水为Milli-Q Plus system（Millipore, Bedford, MA）过滤的18.3 MΩ cm的超纯水、氯仿、硅胶板（GF254）、色氨酸、吲哚乙醇（TOL）(购阿拉丁)、 吲哚乙腈（IAN）（购阿拉丁）、IAA标准品（购Genview）、色胺（TAM）（购Adamas）、吲哚丙酮酸（IPA）（Sigma，USA）和吲哚乙酰胺（IAM）（Sigma，USA）。