番茄WRKY22与WRKY25基因沉默载体的构建(2)
WRKY具有庞大的基因家族，研究发现多种植物中均存在大量WRKY基因。据报道，拟南芥中有72个WRKY基因；水稻中含有100个WRKY基因[5-6]。研究发现，水稻的41个WRKY基因参与非生物胁迫机制，其中27个WRKY基因参与高盐胁迫，16个WRKY基因参与低温胁迫，19个WRKY基因参与干旱胁迫[7]。尽管有许多研究发现，WRKY转录因子参与植物生长发育及抗逆过程，但是，相关转录因子的详细功能和分子机制仍明确。因而，有关转录因子的功能特性和作用机制的探究越来越成为植物基因表达调控机制的焦点之一[8]。
前人通过构建系统进化树分析得知，SlWRKY22、SlWRKY25与AtWRKY22基因同源性较高[9]，研究发现，沉默拟南芥WRKY22基因可有效防御白粉菌的侵染[10]，推测番茄WRKY22、WRKY25基因也有可能参与植物抗病过程。当今，有关WRKY的研究在水稻、拟南芥和烟草等模式植物中较多，但在重要的经济作物番茄中的报道较少。因此，本文以番茄为研究材料，通过VIGS体系，构建pYY13-WRKY22与pYY13-WRKY25沉默载体，为下一步验证番茄WRKY基因功能奠定基础。
1. 材料与仪器
1.1 供试材料
DH5α购自大连宝生公司，pYY13、番茄（Micro-tom）MT均为周口师范学院植物遗传与育种重点实验室保存提供。
1.2 主要试剂
Trizol购自上海拜力生物科技有限公司；2×Taq Master Mix、限制性内切酶PstⅠ、T4 DNA连接酶、dATP及dTTP均属于TaKaRa质粒小提试剂盒购自Aidlab biotechnologies CO.Ltd。
1.3 主要仪器
HVE-50型高压灭菌锅；德国Eppendorf Minispin离心机；DYY-6型电泳仪；DYCP-31A型电泳槽；Tanon 2500凝胶成像系统；雪花制冰机 SIM-F140AY65；
上海精宏生化培养箱；上海智城恒温摇床；德国艾本德5417R型冷冻离心机；赛默飞NanoDrop 2000/2000c 分光光度计；美国Bio-Rad公司 T100 Thermal CyclerPCR仪；实时定量PCR为BIO-RAD CFX96TM Real-time System。
2. 实验方法
2.1 实时定量PCR分析WRKY22、WRKY25的表达模式
生物胁迫处理：取约4周龄番茄植株，将大丽轮枝菌（V. dahliae）稀释至1×107个孢子/mL，接种于番茄根部，并用水做对照；取生长良好的番茄白粉菌（O. neolycopersici）叶片接触侵染实验番茄植株；同时用0.2mg/mL的壳聚糖喷洒番茄叶片，并用水做对照，在不同时间点取样提取RNA。反转录按2.2.2cDNA的合成方法进行，得到相应的 cDNA，然后利用Real-Time qPCR每组三个重复，检测WRKY22、WRKY25这两个基因的相对表达量情况。同时我们取番茄根、茎、叶、花、红果、绿果不同的组织，按照上面相同方法检测WRKY22、WRKY25的空间表达。
实时荧光定量 PCR 反应条件为：预变性 95 ℃，10 sec；95 ℃，5 sec；58 ℃，30 sec，该反应体系共40个循环，用相对定量2-ΔΔCt法对表达量进行相对定量分析，以番茄的Actin为内参。该方法的优点是实时检测表达量变化，简单方便快捷。
2.2 番茄 RNA 的提取及反转录
2.2.1 番茄 RNA 的提取
（1）取2.1保存的不同组织50-100 mg，放入180 ℃灭菌4 h、液氮处理过的研钵中研磨后，置于1.5 mL离心管中，加入 1 mL Trizol充分混匀，室温静置5 min。
（2）向EP管中加入0.2 mL的氯仿，震荡颠倒15 sec，室温2 min。
（3）将离心管置于冷冻离心机中离心10 min，4 ℃ 13000 rpm，将上清液转入新的1.5 mLEP管中。
（4）向EP管中加入0.5 mL的异丙醇，缓慢混匀，室温放置10 min。
（5）将离心管置于冷冻离心机中4 ℃离心， 13000 rpm 10 min，移去上清。
（6）往EP管中加入75%乙醇1 mL，用移液枪吹打沉淀。离心4 ℃，7500 rpm，5 min，倒掉上清。
（7）打开EP的盖子，室温放置晾干，使乙醇挥发，向管中加入DEPC水40 μL，60 ℃水浴5 min，分装于小的EP管中，保存于-80 ℃。
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