木霉T-Aloe为本实验室分离保存。
1.5 mol/L Tris-HCL(pH 8.8)、1.0 mol/L Tris-HCL(pH 6.8)、10 % SDS、30 % Acr-Bis储备液、TEMED工作液、10% APS(过硫酸铵)、IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、甘氨酸、甘油、溴酚蓝、β-巯基乙醇、R-250考马斯亮蓝、冰醋酸、异丙醇、乙醇、蛋白Marker、葡聚糖、DNS溶液、乙酸缓冲液等。
1.1.2 实验设备
    蛋白电泳仪、可见光分光光度计、电子天平、磁力搅拌器、恒温培养箱、恒温水浴锅、水平摇床、恒温摇床、pH计、电磁炉、离心机、研钵、灭菌锅等。
1.2 实验方法
1.2.1 木霉菌株的活化
    对-80℃斜面保存的木霉菌接种到PDA平板上,28℃ 48h 暗培养至长满菌丝或孢子。将活化后的菌丝接种到PD液体培养基上,28℃、180rpm培养24-48h至长出菌丝,之后再接入新的培养基中活化2-3次[8]。
1.2.2 β-1,3-葡聚糖酶的诱导
    通过查阅资料并不断尝试加入不同诱导剂,包括病原菌核盘菌、YK-2菌丝,0.1M TPTG,0.1M乳糖,0.1M葡聚糖分别将进行诱导,28℃、180 rpm培养72h,取出后菌丝研磨得到粗酶液备用[9-10]。
1.2.3 酶活性测定
    参考β-葡聚糖酶活测定的方法[11],以葡聚糖为作用底物,对诱导后的产物进行处理并检测其酶活性。
i 原理
    β-葡聚糖酶水解1,3(4)-β-D-葡聚糖苷键,放出还原糖基团与3,5-二硝基水杨酸(DNS试剂)发生显色反应,其颜色的深浅与还原糖的含量成正比关系,在540nm处测其光的吸收值,查葡萄糖标准曲线,从而得到还原糖的量,据此计算出 β-葡聚糖酶的活力单位数[12]。
ii 试剂和溶液配制
a. 0.1M乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH5.0)
溶液A:量取冰醋酸6ml,定容至1000ml,制成0.1M醋酸溶液;
溶液B:称取8.2g醋酸钠,溶解定容至1000ml,制成0.1M醋酸钠溶液;
使用时以A:B = 3:7的比例混合,低温冷藏备用。
b. 1%的β-葡聚糖溶液的配制
    准确称取0.25g β-葡聚糖放入100ml锥形瓶中,加2ml无水乙醇摇匀到无可见颗粒。加20ml无离子水混合15分钟,盖紧塞子沸水浴5分钟,放置室温自然冷却,或用自来水流动降温。将已冷却到室温的底物溶液倒入25ml容量瓶中,加入2.5ml 0.1M醋酸缓冲液(pH5.0),并用无离子水定容到25ml[13]。
    c. 3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液
溶液A:称分析纯的NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3,5-二硝基水杨酸;
溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g,溶于2500ml水中,再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液;
    将A、B溶液混合,加入1200ml水,定容5000ml,贮存于棕色瓶中,暗处放置一星期后过滤使用。
d. 标准葡萄糖溶液的配制无水葡萄糖80℃烘干至恒重,准确称取100mg溶于100ml水中,加1mg叠氮化钠防腐。4℃冷藏备用。
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