摘 要：本文是依据Genbank上检索的β-葡萄糖苷酶基因DNA序列设计特异性引物，以里氏木霉的cel3d基因组DNA和启动子Pact基因组为模板，用高保真酶probest polymerase进行PCR扩增，获得不同的DNA片段大小，对其进行酶切鉴定和利用琼脂糖凝胶回收。将回收的cel3d和Pact连接并重叠PCR进行酶切鉴定和回收。利用XbaI和HindIII酶将回收的Pact-cel3d与二元载体pCAMBIA-1300上的两个位点连接起来进行克隆，酶切鉴定后送去公司测序。测序的结果表明，所获得的DNA序列与Genbank上检索的β-葡萄糖苷酶基因DNA同源性一致。76758

毕业论文关键词：β-葡萄糖苷酶基因，基因克隆，PCR扩增，序列分析

Abstract：This thesis PCR amplified the β-glucosidase cel3d and actin promoter the from Trichoderma reesei using gene specific primers, its genomic DNA as template and high fidelity enzymes probest DNA polymerase。 The PCR results are analyzed by agarose gel electrophoresis by comparing the size of the DNA fragment。 The correct PCR fragments were then connected by overlapping PCR。 And the connected result, Pact-cel3d, was then ligated to dual carrier pCAMBIA1300 using XbaI and HindIII restriction sites。 The cloning was then analyzed by restriction enzyme digestion and confirmed by DNA sequencing。 

Keywords：β-1,4-glucosidase,  gene cloning,  PCR,  sequence analysis

目录

1 前言 6

2 实验材料与方法 6

2。1 实验材料 6

2。2。1 菌株与质粒 6

2。1。2  培养基及其组成 6

2。1。3  工具酶和常用试剂 7

2。1。4  主要仪器 7

3  实验方法 7

3。1 目的基因（cel3d）的获取 7

3。2 cel3d的扩增 7

3。3 启动子(Pact)的扩增 8

3。4 Pact-cel3d的扩增 9

3。5 Pact-cel3d与运载体结合 9

3。5。1 Pact-cel3d的酶切 9

3。5。2 质粒的提取与酶切 9

3。5。2。1质粒的提取 9

3。5。2。2 质粒的酶切 10

3。5。3 载体DNA和Pact-cel3d的连接 10

3。5。4 将重组子导入大肠杆菌细胞感受态细胞 10

3。5。5 重组子的检测 10

4 结果与分析 11

4。1 cel3d的PCR扩增 11

4。2 Pact的PCR扩增 11

4。3 Pact-cel3d的PCR扩增 12

4。4 质粒DNA片段的PCR扩增 13

4。5 重组子的酶切鉴定 13

5。讨论 16

参考文献 17

致  谢 18

1 前言

目前，世界上纤维素的总干重是50%至30%，是世界上最广泛、最丰富的碳水化合物，也是一种可以再生的优质能源【1】。然而中国每年农作物秸秆的纤维产量达 2 亿吨以上。这些材料具有肠道运动和纤维素转化是利用纤维素的有效途径，而且对解决环境污染、食物短缺和能源危机和人类社会的可持续发展具有重要的现实意义。但是，从自然界中分离纯化得到的的菌种大多酶活性低，酶的组成成分不齐全，远远不能满足工业生产的要求，所以部分都被焚烧，不仅破坏了生态平衡，还污染了环境。微生物产生的纤维素酶不但是用来分对纤维素酶的研究也越来越广泛。纤维素酶是一类能将纤维素分解成葡萄糖的酶的总称，是起协同作用的多组分酶系，具备特异性高、反应条件温和和净化环境的优点。依据纤维素酶系中存在不同功能和性质的酶，纤维素酶可分为三大类 ：内切葡聚糖苷酶、外切葡聚糖苷酶和β- 葡萄糖苷酶【2】。随着人们深化钻研纤维素酶的分子结构及作用机理等各应用，纤维素酶在食品、饲料、环境优化、能源和资源开发等各个领域中发挥越来越大的作用。但是纤维素酶的提取效率一直不高。直到 20 世纪 50 年代初，瑞茜和曼德尔发现里氏木霉(Trichoderma reesei)生产的纤维素酶体系效率高，具有商业化应用的可能性。里氏木霉是一种好氧的多细胞真核微生物，其分泌的纤维素酶属于胞外酶，经过初提和分离纯化就可得到纤维素酶制剂【3】。因为里氏木霉产纤维素酶量高、稳定性好、适应性强、而且可以通过物理和化学方法诱变获取高产菌株，以便于生产和管理，因此研究和利用价值突出。本文就是通过PCR扩增技术，对里氏木霉中的β-葡萄糖苷酶基因cel3d进行克隆，为下一步构建植物表达载体和遗传转化奠定基础。文献综述