裸子植物云杉GDU蛋白异常扩增与进化分析(2)
第一个可能涉及质膜氨基酸出口的基因是谷氨酰胺DUMPER1(GDU1)。GDU1超表达的Gdu1-1D突变体在植物激活标记筛选中被分离[4]，其能改变植物排水器功能。Gdu1-1D型在韧皮部、木质部和吐水流中表现出很高的游离氨基酸含量，导致在排水器中出现谷氨酰胺结晶。在谷氨酰胺转运蛋白介导的非选择性氨基酸输出的研究中，我们可以了解到GDU基因的过度表达能刺激氨基酸流出。所有GDUs都有类似的能够增加氨基酸输出超表达的功能性质。较弱表型的GDU7 OEs可能与来自其他的基因序列分歧有关[5]。在氨基酸外排机制中至少有16种氨基酸是由GDU1高表达增强输出机制的底物。输出不特定于任何氨基酸表明氨基酸输出系统的选择性较差[6]。GDU1刺激的氨基酸出口机制并不是质子梯度或ATP水解，似乎是通过只能向细胞外转运氨基酸的体系介导。缺失编码环型E3泛素连接酶的GDU2(LOG2)是拟南芥中谷氨酰胺DUMPER1(GDU1)诱导氨基酸分泌的必要条件。LOG2和GDU1几乎富集于质膜上[7]，部分见于微粒膜。LOG2 似乎是受 GDU1 高表达影响的途径的必需的组件。GDU1高表达通过一个LOG2依赖通道，即促进未知输出负调节因子的降解或直接影响细胞表面蛋白的运动改变未知氨基酸的输出[8]。
GDU1 编码一种具有单一的跨膜结构域的小蛋白质。在拟南芥中发现旁系同源体[9]，GDU 家族的生理功能是未知的，但任何 GDU 基因的过度表达会导致使人联想到 Gdu1D 的表型。除了膜域，GDU蛋白也负责一个VIMAG域[10]，其能抑制Gdu1D表型，是GDU1功能的必要调节，但是此抑制的分子基础尚不清楚。
有关GDU基因的研究大部分集中在模式植物拟南芥中[11]。通过一个GDU家族基因在不同物种中相对含量的对比中发现(图1)，云杉中GDU基因家族的相对基因数异常。云杉中GDU基因家族的相对基因数相对与其他物种高出几个数量级。云杉作为裸子植物的代表物种，有关GDU基因在云杉植物中的表达情况、其编码蛋白行使的功能以及此异常扩增情况对云杉的影响等问题的研究还存在空白。本研究拟从基因组水平详细剖析云杉GDU家族基因的一些情况，本文将会运用新兴的生物信息学中的分析工具和分析方法对上述问题进行分析。通过运用一系列分析工具对云杉中GDU基因的核酸系列和蛋白质序列进行整合和分析，探讨云杉中GDU基因异常扩增对云杉的影响。同时通过分析云杉的进化关系为解释为何会出现扩增异常这种情况提供一些线索。
图1 GDU家族基因在不同物种中的分布图
1.数据与方法
1.1 云杉GDU基因的检索与下载
用已知拟南芥GDU基因为模版[12]，在云杉基因组数据库中进行BLAST，检索云杉相关GDU基因序列。此外，水稻GDU基因序列直接下载于Phytozome数据库。最终，共检索到77个基因序列，它们来源于拟南芥、水稻和云杉三个物种。下载所有序列，因为云杉GDU基因有63个，数量庞大，为方便后续分析，讲云杉GDU基因按顺序重新命名为PaGDU1～PaGDU63。
1.2 序列比对与系统进化分析
以下载的所有GDU基因序列为对象，用Clustal X软件对GDU家族基因进行序列联配分析，参数设为默认 [13]。然后，利用MEGA软件中的邻接算法对这些比对后的GDU基因进行进化树的构建工作，系统进化树图形被MEGA工具输出，手工对进化树进行细微调整。
1.3 云杉GDU基因的结构分析
以云杉GDU家族基因的DNA序列为基础，在数据库中检索云杉GDU家族基因的编码序列，在GSDS分析软件的相应输入框中输入DNA序列和编码序列进行云杉GDU家族基因结构分析，进而导出GDU家族基因的结构图。
1.4 云杉GDU蛋白保守基序与结构域分析
云杉GDU家族基因的保守基序分析由MEME服务器来执行，其主要参数设置为：保守基序长度范围10~186氨基酸[14]；保守基序最大显示数目为10个，其他参数默认不修改。此外，为探明这些GDU蛋白的功能结构域类型，我们通过Pfam软件分析云杉GDU家族蛋白的序列。