大麦再生体系的构建(2)
目前已有许多研究工作者对影响大麦再生的因素作了许多探究，结果表明，胚龄、植物生长调节剂[6]、基本培养基、基因型、有机添加物[7]、温度、培养条件、光照和外源激素[8]等对大麦的愈伤组织诱导和植株再生影响都很大。但关于同时比较不同大麦品种和不同浓度外源激素诱导的2个量对大麦愈伤组织诱导影响的研究报道很少，实验室中的大麦P01和GP均为常见的品种，探究哪个大麦品种在哪种浓度外源激素刺激下诱导愈伤组织质量最高，为今后的大麦遗传转化进而推动小麦遗传改良提供理论基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1大麦种子
试验中的GP和P01大麦的种子均来自于北京中科院由周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室保存。
1.1.2试剂
75%乙醇，KOH，ddH2O，MS盐，蔗糖，琼脂粉，0.1%升汞，5%NaClO，无水乙醇，NaOH等。
1.1.3仪器设备
超净工作台 ，废液瓶、胶带、皮筋、封口膜、铁架子、打火机、记号笔、EP管（50ml,1.5ml）、生化培养箱、酒精喷壶、智能光照培养箱、4度冰箱、枪（1000μL，100μL，20μL，10μL，1.5μL）、蓝，黄、白枪头、50ml小烧杯、转子、大功率搅拌器、PH计、计算器、计时器、250ml锥形瓶、灭菌锅、精密电子天平、塑料培养皿、镊子、手术刀、酒精灯、口罩、手套、兰花瓶等。
1.2方法
1.2.1大麦无菌苗的培养
①挑选籽粒饱满、均匀的当年收获的GP和P01大麦种子各100粒用镊子去壳后将种子保存在生化培养箱中备用。
②接种前，将实验所需试剂和仪器经酒精喷壶消毒后放入超净工作台，打开超净工作台紫外灯，照射半小时以上，然后关闭紫外灯打开风扇，通风15分钟后即可进入房间进行操作[9,10]。
③先用酒精喷壶清洗双手，打开挡风玻璃检查酒精灯是否合乎要求。大麦种子消毒，首先用0.1%升汞洗大麦种子8分钟，用2个EP管分别装P01和GP，由于升汞有剧毒易挥发，再打开装有升汞的瓶口前应关闭风扇带好防毒口罩和2层手套倾倒升汞时避免溢出撒到手上应将升汞刚好淹没种子最好，倾倒完毕盖好盖子然后上下摇晃EP管管。8分钟后用ddH2O洗一次，避免因不同品种对结果产生影响，我们每个枪头吸取一次后立即打掉到废弃瓶中。接着用5%NaClO洗5分钟不断摇晃。之后用ddH2O洗8次。
④本实验2个大麦品种用4个镊子(2个镊子夹取GP,另外2个夹取P01)2个酒精灯，每个镊子消毒要彻底，镊子底部要烧到通红，其余部分在酒精灯上略微烧一下，灼烧每个镊子大约1分钟。待镊子冷却后开始接种，左手拿提前配好的MS培养基，在酒精灯上方取掉封口膜，然后右手拿镊子，从EP管中夹取大麦种子（注意用镊子的尖夹取），一个培养基中放1粒种子，每个品种接种30粒种子，等到60瓶接种完后，再酒精灯上方慢慢塞上封口膜用皮筋缠好，然后用记号笔写上大麦品种和日期。最后清理实验仪器和试剂，将镊子放入75%乙醇中浸泡，废弃品丢入垃圾箱，可回收利用的物品和仪器，试剂放到指定位置。最后取出配好的培养基放在黑暗条件下培养2-3天，25度。3天后取出培养基放于25度光照条件下培养1周左右。待无菌苗苗长到培养基瓶口处时可用作诱导大麦愈伤组织的材料[11]。
1.2.2大麦愈伤组织的建立
①培养基制备，基本方法同MS培养基[12]（此过程分装后加入琼脂粉）制备相同，但该培养基中还需加入外源激素2，4-D;NAA和Dicamba，每种外源激素分10个梯度。
表1 2，4-D诱导大麦愈伤组织的培养基
培养基序号 成分
MS1 MS+1mg/L2,4-D
MS2 MS+2mg/L2,4-D