2.2.2 基本操作
扩菌:取5毫升LB液体培养基放入试管,接种一个单菌落,将试管放入37℃、250rpm/min的恒温摇床中过夜培养12小时。
接种:菌液以1:1000的比例接种到TBK培养基中,30℃、250rpm/min的恒温摇床中过夜培养12小时。
上清液:将培养过菌株的TBK液体进行9000r/min高速离心,取上清液并加入相应抗生素。
测OD600:从试管中取200毫升到96孔版中,用矿物油密封,用酶标仪测OD600。
CFU:取20ul加入180ul无菌水中进行一定梯度的稀释,然后取10ul菌液加入已倒好LB固体培养基的24孔板中,轻微地摇晃均匀。放入37℃培养箱中静置培养,半小时后倒置。培养20小时左右拿出计数。
感受态细胞的制备与转化:利用SSCS试剂盒一步法制备感受态细胞。
2.2.3 质粒的抽提、检测、转化
(1) 利用SanPerp柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行Wildtype、1408、125、107菌株的质粒抽提,并做好标记。具体操作如下:
1.加1.5ml的已扩好的菌液到1.5ml的离心管中,9,000rpm、离心5min。弃上清,尽可能倒干,收集菌体沉淀。
2.重复步骤1。
3.重复步骤1。
4.加250µl的Solution I重悬菌体沉淀,轻轻地混匀,静置5min。
5.加250µl的Solution II到已混匀的菌体沉淀中,轻轻颠倒6~8次,混匀,室温下放置3min。
(注:阻止染色体DNA的污染,不可有激烈的漩涡,整个溶解时间不能超过5min。)
6.加350µl的Solution III,轻轻地混匀,室温下放置5min,然后12,000rpm、离心10min。
7.小心吸取上步的上清液(约600µl)至EZ-吸附柱中,8,000、离心2min。
8.倒掉收集管中的废液,加入500µl的Wash Solution(漂洗液)于离心吸附柱中,10,000rpm、离心1min。
9.重复步骤8。
10.打开离心管加热器,调至60℃。
11.倒掉收集管中的废液,10,000rpm、离心2min,尽量除去Wash Solution中的乙醇。
(注:打开吸附柱的盖子,再在室温下静置10min,以挥发剩余的乙醇。)
12.将Elution Buffer(洗脱缓冲液)放入离心管加热器中加热至60℃。
(注:Elution Buffer加热至60℃可提高提取的效率。)
13.取出离心吸附柱将其套入一个干净的1.5ml的离心管中,在硅基质膜中央部位加入50µl已加热至60℃的Elution Buffer,室温放置2min,然后10,000rpm、离心2min。
(注:加入Elution Buffer时必须缓慢滴入,不冲破硅基质膜。)
14.将目的质粒DNA标记好名称保存于﹣20℃。
(2) 利用琼脂糖凝胶电泳法进行质粒检测。具体操作方法如下:
1. 稀释TAE电泳缓冲液,将1×50TAE缓冲液稀释50倍,如20mlTAE加入到980ml的蒸馏水中。
2.用蒸馏水将电泳槽,制胶器和梳子冲洗干净,放在水平的桌面上,在电泳槽中倒入稀释好的TAE电泳缓冲液。
(注:电泳槽中的TAE电泳缓冲液可循环使用。)
3.用电子天平称量0.3g的琼脂糖倒入干净的三角瓶中,量取30ml1×TAE缓冲液加入到三角瓶中,微波炉加热约30s,使三角瓶中溶液沸腾持续约10s,取出三角瓶至室温冷却。
(注:根据所需凝胶的大小,增减琼脂糖和缓冲液的量。加热时,沸腾时间不足琼脂糖溶解不完全,太长会溢出,短时多次加入,溶解要均匀。)
4.待琼脂糖冷却至约50℃,用移液枪加入1µlEB,摇匀。
(注:要及时摇匀,不然形成的凝胶会有色差,导致观察困难。)
5.将琼脂糖小心倒入制胶器,避免产生气泡,迅速在一端插入梳子。
6.待胶完全冷却凝固后,拔出梳子,将凝胶同制胶器一起放入电泳槽,补加1×TAE缓冲液使液面高于凝胶表面约3~5mm。
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