超折叠绿色荧光蛋白纳米抗体复合体结构功能学研究(2)
4.1实验仪器和材料24
4.2实验方法25
4.2.1sfGFP的凝血酶酶切实验.25
4.2.2复合体的Native-PAGE.25
4.2.3复合体的SDS-PAGE25
4.2.4复合体的蛋白免疫印迹杂交验证.26
4.3结果与讨论26
4.3.1sfGFP的酶切实验结果.26
4.3.2SDS-PAGE与Native-PAGE对复合体的分析27
4.3.3Westernblot对复合体的分析28
结论.29
致谢.30
参考文献.31
1 引言 1.1 绿色荧光蛋白及其变体的结构功能学进展 1.1.1 绿色荧光蛋白简介 绿色荧光蛋白（GFP）最早于二十世纪优尔十年代由下修村（Osamu Shimomura）等[1]科学家们从文多利亚水母（Aequorea victoria）中分离得到的。随着绿色荧光蛋白在生命科学领域的广泛应用，2008 年诺贝尔化学奖颁给了对绿色荧光蛋白的发现，表达和应用做出突出贡献的三名科学家：Osamu Shimomura、Martin Chalfie 和Roger Y. Tsien。 GFP 可以在蓝光照射下发出明亮的绿色荧光，在水母体内时，其自身的冷光蛋白质Aequorin 可以与钙离子（Ca2+）相互作用，产生蓝色荧光，该光源激发 GFP产生绿色荧光。激发出的绿色荧光能持续较长时间，并且不需要其他任何辅因子或者底物的相互作用，其荧光发色团为GFP 一级序列所固有[2]。
绿色荧光蛋白结构 来源于文多利亚水母的野生型的 GFP 的相对分子量较小，约为 27 KDa，cDNA 只有717 nt，即由238 个氨基酸残基连结构成，其中的荧光发色团位于氨基酸残基 64-69 位的优尔肽中，但更确切的来说是 65-67 位（Ser65-Tyr66-Gly67）的氨基酸残基[3]。GFP基因在翻译成多肽链后，折叠环化形成正确结构，其发色团也在 2-4 小时内自动催化形成。发色团的形成主要是在氧气的存在条件下，分子内 Gly67 的酰胺对第 Ser65 的羧基的亲核攻击形成第 5 位碳原子咪唑基, Tyr66 的 α-2β键脱氢反应之后，形成对羟基苯甲酸咪唑环酮发色团。因此，由于GFP发色团的形成需要氧气的参与，所以在无氧环境下，GFP无法发出荧光[4]，
即为发色团产生机制的简略形式。尽管 GFP的荧光主要由生色团产生，但根据末端随机缺失实验现象显示，GFP高级结构的稳定存在需要所有的氨基酸残基的共同参与。1996 年报道的首个 GFP 的晶体结构[1][5]显示出 GFP 是由 11 条 β-折叠组成的柱状结构，就像一个桶，直径约 3 nm，长约4 nm。 柱中央由单一的 α-螺旋形成，发色基团就附着于 α-螺旋上，并且非常靠近柱的中心。 野生型的GFP的光谱是GFP 类型蛋白中最为复杂的，包括 395 nm的荧光激发主峰， 475 nm的副峰约为主峰的 1/3，在激发荧光时，发射光谱的主峰在 508 nm，并且在540 nm左右有一个侧峰[6]
。尽管荧光激发主峰在 395 nm，但是由于 GFP 在450 至490 nm的蓝光范围内最为稳定，在 340 至390 nm 或者395 至440 nm 的范围中时，会产生光漂白的现象，所以荧光的激发通常是在蓝光条件下进行。 图 1.2 野生型 GFP的激发光谱（蓝色）和发射光谱（绿色） 尽管野生型 GFP 有着众多优良特性，但是随着 GFP 越来越广泛的应用，野生型的 GFP已经难以适应当前研究的需要。因此，为了拓宽 GFP 的应用范围，越来越多的改进的 GFP变体被开发出来。其中包括更换 GFP荧光发色团氨基酸、改变部分位置的碱基构成等众多途径使得 GFP 热稳定性增加，荧光强度提高，荧光发色团乃至 GFP 的折叠效率都得到提高，荧光特性也得到不同程度的改善，并且开发出了蓝、红、绿、青等多种色彩的荧光蛋白，开辟了GFP 的新的研究领域。其中一种比较有代表性的突变体为增强型 GFP（EGFP），主要特征为65 位丝氨酸替换为苏氨酸（S65T），64 位苯丙氨酸替换为亮氨酸（F64L），使得GFP的荧光强度增强了几十倍，并且激发后一天一夜仍可检测到足够强度的荧光信号[7]。 1.1.3 绿色荧光蛋白的优点及其应用 自GFP发现至今，其在生命科学的各个领域都有着极大的发展与应用，其中最主要的一个方面是用于分子标记，作为报告基因。GFP 之所以在分子标记方面有着极大的潜力，是因为它众多的特性[8]，包括（1）无种属依赖性，在多种动植物中都能成功表达；（2）荧光强度高且稳定，能在普通的荧光显微镜或者肉眼下就能直接观测到；并且对一定温度，有机溶剂等有着较强抗性；（3）荧光的产生无需反应底物或者辅助因子，可直接适用于生物体内的实时监测；（4）较小的相对分子量使之容易与其他蛋白的融合，例如在神经元细胞中。（5）截止目前来看，GFP 对细胞无毒害作用，对其他功能也没有影响。 GFP 在作为一种报告基因和细胞的融合标记等方面的优势是其他报告基因难以比拟的。例如，在质粒转染效率的测定方面，将含有 GFP 的表达载体转入不同的细胞中，进行瞬时表达，可以了解不同细胞之间的转染差异[9]。在基因工程的细胞筛选方面，将所需基因融合上GFP 的基因序列后转入细胞中，在诱导蛋白表达时即可检测有荧光信号的细胞，即为含所需基因的细胞。在细胞发育研究中，GFP 可跟踪细胞在发育过程中的变化，观察不同时期的细胞表达情况，以此显示细胞在发育过程中的相关信息。 除分子标记方面作用，也可以作为一种光学传感器，通过定向突变得到的很多对环境敏感的 GFP，可作为环境指示剂[5]。并且，依此得到的启示，还得到对 pH 敏感的 GFP，用于检测细胞内各环境下的 pH。