1.1 菌株及试剂 10

1.2 菌株培养 10

2 实验方法 11

2.1 氧化胁迫处理方法 11

2.2 三萜含量测定 11

3 结果分析 12

灵芝在应对不同环境刺激下外源性硫化氢的调控作用

第一节 硫化氢致死浓度确定

前言

硫化氢存在于灵芝菌株内，并且参与灵芝生理活动，但是过量的硫化氢对灵芝产生毒害作用，抑制灵芝菌丝的生长，在此实验中，我们设置了不同浓度梯度的NaHS作为实验组，研究灵芝菌株的硫化氢致死浓度。

1.实验用菌株和试剂

实验中使用的菌株为上海农科院提供的灵芝G20菌株。试剂均为分析纯。

2.实验方法

配置15块含有不同浓度NaHS的CYM培养基，分别为CK3块，10umol/L3块，50umol/L3块，100umol/L3块，200umol/L3块，接种同一培养基上同一直径的菌种，在恒温培养箱中培养24h后每隔12h测定菌落直径，比较其生长状况。

3.实验结果与分析

可以看出CK，10、50、100 umol/L的曲线图基本重合，而200umol/L的实验组数据曲线则明显偏离，说明200umol/L的NaHS对菌株的生长有较强的抑制作用。所以在后续的实验中，添加的NaHS浓度一般在200umol/L以下。

第二节 硫化氢在热胁迫对灵芝的影响中的调控

前言

热胁迫是微生物成长过程中经常遇到的环境胁迫因子。热胁迫影响蛋白的合成、染色体及线粒体的结构和功能论文网、质膜流动性及细胞骨架结构的稳定性，并改变细胞的酶促反应效率及细胞分裂，进而引起代谢失调，严重影响微生物的生长发育甚至导致死亡。[2]

微生物固定生活的特点常常遭遇热胁迫的伤害，因此在长期进化过程中形成了一系列应对热胁迫的方法。下面将分别从微生物应对热胁迫的形态特征、生理变化等宏观层次以及微生物应对热胁迫的分子机制等微观层次予以描述。[3]

微生物在遭受热胁迫时经常出现为生物量的下降，菌丝生长变缓，菌丝体、子实体形态变差，孢子萌发能力降低，定殖力下降等情况。研究表明热胁迫降低酿酒酵母的生长速率。香菇(Lentinus edodes)是一种低温食用菌，其菌丝在30℃时的生长速度显著下降，在35℃时生长停止但不死亡。出菇阶段，高温下(20℃以上)子实体发育快，菌柄长，但菌肉变薄，品质严重降低。热胁迫会使双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的子实体发黄，菌盖变小，产量下降。[4]

菌丝形态对于丝状真菌的生长发育及侵染十分关键。据报道，菌丝形态与生长温度相关。热胁迫下，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的菌丝变长但极性生长降低，生物膜变薄，侵染力下降。热胁迫会影响白色念珠菌(Candida albicans)酵母形态与菌丝形态之间的变化，影响其对宿主的侵染能力。在米曲霉(Aspergillus oryzae)中，热胁迫会使其菌丝尖端生成应激颗粒。

面对热胁迫，微生物必须改变自己的生理活动，改变生活方式，来适应这种胁迫。细胞周期的瞬时中断，相容性渗透调节物质的合成，细胞壁重组等都将有利于提高微生物在高温下的存活率。如果微生物细胞内的相关保护机制都不足以对抗热胁迫，那么微生物可能会受到严重的热损伤。

灵芝是一种名贵的药用真菌，具有极佳的药用价值和商业价值。灵芝菌丝的正常生长和子实体发育与温度等密切相关。在此实验中我们将要研究硫化氢在调控热胁迫方面的作用。

硫化氢增强灵芝耐热性的途径与抗氧化系统，渗透物质调节，钙信使系统，热激蛋白等相关。硫化氢可以调节抗氧化系统的活力，增强抗氧化酶的活性，使灵芝体内的活性氧维持在一个较低的程度；硫化氢能够在高温环境下增长脯氨酸，可溶性糖，甜菜碱，海藻糖等渗透调节物质的含量，从而减缓由高温引起的灵芝的渗透胁迫；以钙和钙调素为核心的钙信使系统能够调控硫化氢诱导灵芝耐热性的形成；热激蛋白能够作为分子伴侣帮助蛋白质重新折叠，防止蛋白质凝集，促进蛋白质转运，促进分解变性蛋白质以及参与信号转导，是灵芝耐热性提高的重要物质，而硫化氢能够促进热激蛋白的合成，增强灵芝的耐热性。