茄科植物对番茄白粉病菌的抗性分析(2)
1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 供试材料
珊西烟、烟草W38、烟草NC89、本氏烟、龙葵、酸浆来自周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室植物培养室；番茄白粉病菌取自周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室内番茄白粉病菌感染的番茄叶片。
1.1.2 实验染色试剂
DAB溶液（浓度：1mg/mL，pH3.8）；固定液（无水乙醇:冰醋酸=3:1）；0.3%的台盼蓝溶液。
1.2 主要仪器
奥林巴斯BX41正立显微镜。
1.3 试验方法
1.3.1 茄科植物的种植
首先将4种烟草、龙葵、酸浆这6种茄科植物的种子在1.5mLEP管中进行消毒。用70%的乙醇浸泡种子30s，倒掉乙醇用无菌水清洗种子1~2次。然后用2.5%的次氯酸钠浸泡种子8~10min，倒掉2.5%的次氯酸钠用无菌水清洗4~5次。最后在EP管中留少许水，以便播种。将消毒过的种子播种到MS固体培养基内。置4℃冰箱内春化2~3d，之后转入光照培养，培养2w后将小苗移栽到无菌的营养土上，移栽后覆盖薄膜，2d后每天将薄膜揭开一点儿，5d后完全揭膜。
1.3.2 感染番茄白粉病菌
待3w后6种茄科植物长出5~8片叶片时用质量好无杂质的番茄白粉病叶片进行感染。先用洗耳球轻轻吹掉叶表面老孢子，然后用产生新孢子的叶片有菌面轻压待接种的茄科植物叶片，在温度为22℃条件下通过叶面喷雾的方法进行保温保湿培养[12]。
1.3.3 显微观察番茄白粉病菌生长情况
本实验采用DAB和台盼蓝同时染色的方法进行番茄白粉病菌的显微形态观察。根据番茄白粉病菌的生长特点，在感染后第1d，第3d，第5d，第13d定时取样观察菌丝的生长情况。
1.3.4 番茄白粉病菌的DAB和台盼蓝同时染色的步骤[13]
①取感染的叶片，将其叶柄剪成斜面，插入盛有DAB溶液的EP管中，溶液不需太多，浸过叶柄的斜面即可。
②光照下静置5h，肉眼可观察到棕红色的DAB溶液沿着叶脉到达叶片的顶端。
③将整个叶片剪切成1.5cm×1.5cm的小块（视叶片大小而定），并浸没于固定液中，过夜脱去颜色。
④将叶片组织放置于EP管中，用0.3%的台盼蓝溶液覆盖叶片，将其置于沸水中，煮沸30s。然后用纯水将台盼蓝冲洗掉用于显微观察，或将叶片置于水合三氯乙醛中以备显微观察。
1.3.5 显微观察拍照
将染色好的叶片做成装片，在奥林巴斯BX41正立显微镜下进行观察拍照。
2. 结果与分析
2.1 番茄白粉病菌的形态
番茄白粉病菌的分生孢子梗直立，简单不分枝（见图1-D），无色，分生孢子椭圆形（见图1-A），单生于分生孢子梗顶端，无色，侧面萌发（见图1-E）。芽管有裂片状或直筒形[11]。番茄白粉病菌侵入植物的过程可划分为6个阶段。即分生孢子萌发（见图1-B）、附着胞形成及侵入、产生初生吸器（见图1-C）、次生菌丝的扩展及产生次生吸器、菌丝扩展和菌丛形成（见图1-F）、产生分生孢子链[14]。
图1 番茄白粉病菌的显微形态结构图
注：A：番茄白粉病菌孢子；B：孢子萌发；C：孢子在叶片上产生的吸器；D：分生孢子梗；E：孢
子侧面萌发；F：长时间后孢子萌发成菌丛。
2.2 番茄白粉病菌侵染茄科植物的生长情况
采用DAB和台盼兰同时染色的方法对定期取样的叶片进行显微形态学观察。结果发现：珊西烟、烟草W38、烟草NC89、龙葵、酸浆第1d取样显微观察时有少数孢子萌发（见图2-A1、A2、A3、A5、A6）；第3d取样显微观察时发现珊西烟、烟草NC89大部分孢子已经萌发，产生了附着胞（见图2-B1、B3），而烟草W38、龙葵、酸浆叶片上有些菌丝上产生了吸器（见图2-B2、B5、B6）；第5d取样显微观察时发现有分生孢子梗初步形成（见图2-C1、C2、C3、C5、C6）；第13d取样显微观察时发现形成菌丛，长时间后植物表面出现了白粉病症状（见图2-D1、D2、D3、D5、D6）。
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