4.2.3 重组子酶切验证电泳检测 24

4.3 RBR干涉基因载体转化普通本氏烟 24

4.3.1预备养 24

4.3.2 共培养、筛选培养、继代培养 25

4.3.3 生根培养 25

第五章 讨论与研究意义 26

参考文献： 28

致谢： 29

引言：

    近年来，双生病毒引起的番茄曲叶病毒在我国南方省份（云南、广东、广西、浙江、上海、北京等多个省市）发生面积大、发展迅速、危害严重。由于双生病毒基因组变异快、病毒复合侵染严重且重组频繁、介体烟粉虱能持久高效传毒等，造成该类的病毒防治异常的困难，而生产上使用的品种绝大多数对双生病毒感病，感病植株一般表现为花叶、曲叶、黄化等症状，严重地影响了植物的正常生长，对农业生产造成巨大的危害。双生病毒科，是植物病毒中唯一具有单链DNA的单分体或二分体基因组病毒，长度约为2400nt～3000nt。在我国发现的双生病毒均属于菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）。该属病毒仅侵染双子叶植物，因自然传播媒介均为烟粉虱（Bemisia tabaci），故称为粉虱传双生病毒（Whitefly -transmitted geminiviruses,WTG)。其基因组结构较为简单，但其复制及转录调控却相当复杂。现有实验发现粉虱传双生病毒DNA复制理论仍然存在暗区，RBR蛋白不是唯一的细胞周期调控因子,双生病毒可以通过和现有发现不同的未知因子互作来调控细胞周期，需要通过相关研究来明确。

本氏烟（Nicotiana benthamiana, Nb）是一种优质的用于植物病毒学研究的模式植物。大多数的植物病毒极易感染于本氏烟，而且本氏烟也是其它病原微生物如细菌、卵菌、真菌等的宿主。另外，本氏烟生长周期短，植株较小易于栽培，而且具有良好的遗传转化和再生能力，是研究双生病毒复制蛋白的结构和功能的生物材，本实验将在野生型本氏烟的基础上构建双生病毒复制相关植物内源基因NbRBR1的基因干涉和基因过表达的转基因植株，并在这一实验材料的基础上开展双生病毒复制调控的研究。

第一章 材料与方法

1.1 材料

 1.1.1 菌株与质粒

感受态大肠杆菌细胞（Escherichia coli) DH5和Trans-T1购自全式金公司。pCAMBIA2300、pEGFP质粒、农杆菌菌株EHA105为实验室保存。pRNAi-LIC质粒由杭州师范大学植物RNA信号传导中心主任洪益国教授提供。

 1.1.2 受体植物

本氏烟（Nicotiana benthamiana)生长在无虫恒温（25℃）温室中，并给予16 h光照/8 h黑暗。

 1.1.3 酶及化学试剂

    实验室所用的各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶等均购自NEB公司，Taq plus DNA聚合酶及Prime Star（PS）高保真聚合酶，购自TAKARA公司，PCR产物回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自Qiagen公司，PCR引物合成、DNA片段测序均由上海英俊生物科技有限公司完成。

 1.1.4 抗生素

    链霉素、卡那青霉素、氯霉素。

 1.1.5 常见试剂配制

常用的缓冲液和化学试剂的配制见附录A。

 1.1.6 实验仪器

小型离心机（Eppendorf centrifuge 5424）；PCR仪（BIO-RAD C1000 Thermal cycler）；凝胶成像系统（BIO-RAD GelDoc XR+Gel Imaging System）；细菌培养箱（美国Thermal公司）；超净工作台（苏净）；生物安全柜（Thermal）。

1.2 实验方法

 1.2.1 野生型本氏烟植物总RNA的提取