1.3.4 有机酸的收集和测定
1.3.4.1 有机酸的收集、纯化和浓缩
处理后 8 d 后开始收集根系分泌物,将小麦植株用自来水和蒸馏水冲洗数次后,用吸水纸吸干,放到含有 50 ml 双蒸水的烧杯中,在光照培养箱中培养收集 12 h ,培养收集完毕后,用双蒸水冲洗根系表面数次,合并冲洗液并定容至 100 ml ,此溶液即为收集到的根系分泌物。收集液采用冷冻干燥技术浓缩至 5 ml ,保存于 -20 ℃ 冰箱中待测。
1.3.4.2 有机酸的测定
本实验共测定草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、乙酸 5 种有机酸。取小麦植株鲜样 1.0 g ,加入 5 ml 超纯水冰浴研磨,提取液在 80 ℃ 水浴震荡 1 h ,然后 10000 r / min ,离心 15 min ,上清液过 0.45 m 滤膜,有机酸含量用 HPLC 测定,柱温:30 ℃ ;流动相为含 1 % 甲醇的 20 m M KH2PO4( pH 2.8 )缓冲液;流速为 0.6 ml / min;波长 214 nm ;进样量:20 l。
1.3.5 小麦根系分泌有机酸对 Cr6+ 络合效应
采用平衡透析法:将 20  ml 有机酸(第 8 d收集)装在透析袋(MW = 200)内,接着浸泡在 200 ml 100 mol . L-1 Cr6+ 溶液中,12 h后取出透析袋,在去离子水中平衡 12 h ,重复 3 次。去除游离的 Cr6+,将透析袋内的液体倒出,加浓 HNO3  10  l / ml ,定容至 50  ml ,测定透析袋内 C r的浓度。
1.3.6小麦根系分泌的有机酸清除 DPPH (2,2-diphenyl-1-piCrylhydrazyl,二苯代苦酰基)自由基作用
    分别吸取 2.5 ml 不同处理的小麦根系分泌的有机酸溶液,蒸馏水稀释到 5 ml ,加入5 ml  1 m mol.L-1  DPPH 自由基溶液,混合后振荡 1 min ,室温反应 30 min ,以无水乙醇作为空白, 517 nm 波长下测定吸光度( A1 ),每组平行测定 3 次,取平均值。
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