水稻(Oryza sativa L.)是一年生禾本科植物,是我国重要的粮食作物,同时也是世界上三分之一人类的主食[1]。随着我国人口的增加以及耕地面积的不断减少,培育出高产质优的水稻品种尤为关键。叶片作为光合作用的重要场所,水稻抽穗后籽粒灌浆所必须养分60%—90%来自叶片的光合作用[2]。理论上说,如果灌浆期水稻叶片的衰老每推迟一天,就可以使水稻产量大概增加2%,实践表明,田间可增产1%左右(梁建生,1993;刘道宏,1983)[3]。水稻叶片衰老会减少植株干物质的积累,严重影响水稻产量,因此对水稻叶片衰老机制的研究具有重大的理论和实际意义。影响水稻叶片衰老的因素有外界因素和内部因素,现有的数据表明,外界因素主要有高低温,细菌侵染,黑暗处理,以及营养物质的缺乏,水分不足等,内部因素包括植物体内各种各样的激素,比如脱落酸,细胞分裂素等,以及生长发育和发育年龄等,因此,叶片衰老是受外界和内部多种因素共同调节,整个植物体精细调控的过程。目前,关于叶片衰老的假说有很多种,自由基损伤假说,DNA损伤假说,激素调控学说,程序性细胞死亡理论等[4]。为了研究水稻叶片衰老突变体的机理,本实验对叶衰突变体es2进行实验,对es2基因进行定位,确定了基因的具体位置,实验取得成功。

1 材料与方法

1.1  实验材料

    本实验材料选取自通过化学试剂EMS诱导的野生型水稻SH,获得系列水稻叶衰突变体es2,将突变体es2与野生型水稻Nipponbare杂交获得大约2000株的F1群体。将F1群体进行自交,获得F2分离群体,发现分离群体中野生型与突变体表型个体比例为3:1,说明该突变为隐形突变。选取F2群体的200株突变体表型作为本次实验的实验材料。

1.2  实验方法

1.2.1  DNA提取

    本研究采用SDS法提取水稻基因组DNA,提取步骤如下:

1)磨样:取水稻叶片2-3 cm(约50-100 mg)放入2.0 ml的离心管中,加入一颗钢珠,盖好盖子,将离心管放入液氮中冷却,再用研磨机进行研磨,将叶片研磨成粉状。

2)加入400 ulDNA提取液,75℃水浴锅恒温水浴30 min,每十分钟混匀一次(可适当延迟水浴时间)。

3)水浴结束后将离心管放入离心机中12000 rpm,离心10 min。

4)吸取上清液加到新的1.5 ml离心管中,然后加入相同体积的异丙醇,上下颠倒混匀,再放入4℃冰箱静置5分钟。

5)12000 rpm,离心10分钟,弃上清。

6)加入200 ml70%的乙醇溶液洗涤DNA沉淀,并于8000 rpm,离心5 min,弃上清。

7)最后将离心管放入超净台,等待数分钟风干后,加入 200ulddH2O或TE溶液,使其溶解DNA,在-20℃冰箱中保存备用。

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