2.2体视显微镜下的观察

1) 取材：挑取赤拟谷盗和杂拟谷盗成虫各30头，分别放入盛有70%的酒精的EP管中。

2) 清洗：将上步骤中的EP管放入超声波清洗器中50KHz、29℃清洗15min。

3) 干燥：将清洗好的试虫放在干净的平皿中自然晾干。

4) 样品观察：将干燥好的试虫放在体视显微镜下进行观察，对主要的部位进行拍照。

2.3赤拟谷盗和杂拟谷盗头部RNA的提取

取50-100mg成虫头部组织放入液氮预冷的研钵中，加入少量液氮，快速研磨至粉末状，倒入有1ml细胞裂解缓冲液（1% SDS，50 mmol/L Tris-HCl， 25 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA）的离心管中；

1) 在EP管中加入0.2ml的氯仿，上下震荡混匀，室温下静置5min ；

2) 将EP管放入高速冷冻离心机中，4℃ ， 12000rmp 离心 15min，取上清；

3) 将约500ul的上清转移到离心柱中，加入250ul的无水乙醇，充分混匀，4 ℃ 12000rmp离心1min ，弃掉收集管中的废液；

4) 加入 500ulRNA漂洗液，静止1min，12000rmp离心1min ，弃掉收集管中的废液；

5) 将离心柱转移到无RNAse离心管中，加入30-50ulDEPC处理的水12000rmp离心1min。

收集提取的RNA放入-20℃的冰箱中备用。

2.4 cDNA第一条链的合成

1) 在灭菌的DEPC水处理后的EP管中分别加入1ul的3-RACEP1（0.5ug/ul）和2ul的RNA模板，用水补充至体积为13ul；

2) 将步骤1中的加完样的EP管放入70℃的水浴中5min，取出放入冰浴中冷却5min；

3) 在上面的EP管中根据下表依次分别加入这些试剂

成分 体积(μL)

5×第一链缓冲液 4

dNTP 2

核酶抑制剂 0.5

MMLV 0.5

加水至 20

4) 混匀EP管中的样，离心后，放置42℃ 水浴锅中60min；

5) 将EP管于95℃下加热5min，灭活反转录酶；

6) -20℃保存cDNA，备用。

2.5 TDT加尾反应

在微量离心管中配制下列反应液，全量为50ul，37℃下反应30min

成分 体积（ul）

5X TDT buffer 10

0.1% BSA 5

10mM DGTP 2.5

TDT 15

第一链合成产物 20

双蒸水 up to 50 

2.6 LW视蛋白基因的克隆

2.6.1视蛋白LW基因的5＇RACE 实验步骤