高产酯化酶复合菌剂的研制+文献综述(3)
芽孢菌酯化酶筛选培养基[12]：酵母膏0.7 g，蛋白胨1 g，葡萄糖1 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.2 g，硫酸铵0.2 g，琼脂粉20 g，三丁酸甘油酯4 mL，水1000 mL，pH值7.2-7.4；
发酵培养基[13,14]：麸皮培养基和营养液的比例为1:5，其中营养液（g/L）配方为：硫酸铵 1.5 g，硫酸镁 0.3 g，磷酸二氢钾1.5 g，氯化钙0.3 g；麸皮培养基：麸皮和水的比例为1:1。
以上所有培养基灭菌条件：0.1 MPa，121 ℃，30 min。
1.2 主要仪器与设备
PL601-L电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司生产；80-2离心沉淀器，江苏省金坛市医疗仪器厂生产；LRH系列生化培养箱，上海一恒科技有限公司生产；SYQ-DSX-280B不锈钢压力蒸汽灭菌器，上海一恒科技有限公司生产；101-型电热鼓风干燥箱，北京科伟永兴仪器有限公司生产；SW-CJ-2FD型洁净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司生产；BC/BD-426HY冰柜，河南新飞电器有限公司生产；
1.3 主要实验方法
1.3.1 菌株的活化
1.3.1.1 芽孢菌的活化
将实验室保存的10株芽孢菌转接到芽孢菌种子液培养基上，55℃、150 r摇床培养24 h进行第一次活化。然后用接种环挑取一环摇床培养好的芽孢菌在芽孢菌活化培养基中进行划线分离，55℃培养24 h进行第二次活化。
1.3.1.2 酵母菌的活化
将实验室保存的10株酵母菌转接到酵母菌种子液培养基上，28℃、150 r摇床培养3-5 d进行第一次活化。然后用接种环挑取一环摇床培养好的酵母菌在活化培养基中进行划线分离，28℃培养3-5 d进行第二次活化。
1.3.1.3霉菌的活化
将实验室保存的10株霉菌转接到霉菌种子液培养基上，28℃、150 r摇床培养3-5 d第一次活化。然后用接种环挑取一环摇床培养好的霉菌在霉菌活化培养基中进行划线分离，28℃培养3-5 d进行第二次活化。
1.3.1.4 乳酸菌的活化
将实验室保存的5株乳酸菌转接到种子液培养基上，37℃、150 r摇床培养24 h第一次活化。用接种环挑取一环摇床培养好的芽孢菌在活化培养基中进行划线分离，37℃培养24 h进行第二次活化。
1.3.2 高产酯化酶菌种的筛选
1.3.2.1 产酯芽孢菌的筛选
将活化好的芽孢菌点种于含三丁酸甘油酯的产酯酶芽孢菌筛选培养基平板上，55℃培养24-48 h，菌落周围有透明圈的为酯酶产生菌，并用直尺分别量取透明圈直径（R）和菌落直径（r），根据两者的比值即R/r大小初步确定酶活性的高低，R/r值最大者为初筛菌株。
1.3.2.2 酵母菌的筛选
将活化好的酵母菌点种于含三丁酸甘油酯的产酯酶酵母菌筛选培养基平板上，30℃，培养3-5 d，菌落周围有透明圈的为酯酶产生菌，并用直尺分别量取透明圈直径（R）和菌落直径（r），根据两者的比值即R/r大小初步确定酶活性的高低，R/r值最大者为初筛菌株。
1.3.2.3 霉菌的筛选
将活化好的霉菌点种于含三丁酸甘油酯的产酯酶霉菌筛选培养基平板上，30℃，培养3-5 d，菌落周围有透明圈的为酯酶产生菌，并用直尺分别量取透明圈直径（R）和菌落直径（r），根据两者的比值即R/r大小初步确定酶活性的高低。
1.3.3 种子菌悬液的制备
按照每20 mL蒸馏水加入3环菌的比例配制菌悬液。
1.3.4 产酯化酶多元菌株混合发酵产酯酶试验
1.3.4.1最佳二元菌混菌比例的确定
将种子菌悬液分别按照芽孢菌和酵母菌、酵母菌和霉菌以及芽孢菌和酵母菌4:1、4:2、4:3、4:4的比例配制成混合菌液。将配制好的混合菌液按照4％的接种量接种于100 mL发酵培养基上，30℃、135 r／min条件下连续培养3-5 d，测其酯化酶活力，同时将单菌株发酵作对照，测定酯化酶活力，酶活力最高的混菌比例为最佳混菌比例。