但目前关于樟树内生真菌的研究较少。本实验采用组织分离法,从樟树的不同部位分离樟树的内生真菌,并对其发酵代谢产物进行HPLC分析,从而初步判断樟树内生菌是否与樟树产生的代谢产物是否相同,也为樟树的进一步开发研究提供一些参考。 

2 材料与方法

2.1 实验材料与试剂

2.1.1 实验材料

健康樟树的茎、叶,采取来自淮阴师范学院文心路两旁。

2.1.2 培养基源'自:优尔`!论~文'网www.youerw.com

马铃薯葡萄糖培养基(PDA):马铃薯200 g(去皮切块煮碎过滤)、葡萄糖20 g、琼脂16 g、蒸馏水1000 ml,pH自然值。

2.2  主要仪器设备

电子天平,赛多利斯(北京)有限公司; SW-CJ-ID型生物洁净工作台,苏州进化设备有限公司;MP-250B型霉菌培养箱,上海福马设备有限公司;HZQ-Q型全温振荡器,中国·哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;RE-3000旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;HH-8数显恒温水浴锅,江苏金坛市亿通电子有限公司;SHB-III循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;低温冷却循环泵,郑州长城科工贸有限公司;BCD-207H型海尔冰箱;inifinte1260高效液相色谱(配备G1311A四元泵、G1315B紫外检测器、G1313A自动进样器、G1379A柱温箱、部分收集器和Chemstation工作站),美国Agilent公司。

2.3  实验方法

2.3.1  内生菌的分离、纯化及保存

采取来自学校道路两旁的健康樟树的茎和叶,分别用自来水冲洗干净并用吸水纸吸干水分,再对其表面进行消毒。消毒方法:在超净工作台中,先用75%酒精浸泡茎2.5min、叶1min,再用无菌水冲洗3次,然后用0.1%升汞分别浸泡1 min,无菌水冲洗3次。

继续在超净台中将消毒好的材料用无菌镊子挑取放入无菌培养皿中,培养皿事先放好灭好菌的吸水纸吸干水分,将其表皮剥离,用无菌手术刀纵切枝干,茎相同,并将切口对向培养基,放入其中。叶片剪去边缘,死边,再切成0.5 cm ×0.5 cm 小块,将其插入到PDA培养基中。

将上述材料经最后一次无菌水涂布在培养基表面。放入28℃恒温箱培养,如未发现材料周围长出任何菌,则证明所分离的菌株为樟树的内生菌。

 将放入好材料的PDA培养基放在28℃恒温箱中,培养3-7天。观察外植体侧面或顶端有无菌落形成,每隔12小时观察一次,如果长菌,挑取生长旺盛的菌落用平板划线的方法在培养基中纯化数次,将纯化好的菌种接种到事先做好的PDA斜面培养试管上放入4℃冰箱保存备用。

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