本实验目的是从土样中筛选出具有降解生淀粉能力的菌株，测定其酶活[14-15]。由于玉米是国内外许多国家的淀粉原料，所以筛选出能降解玉米的生淀粉糖化酶将会拥有巨大的潜在经济价值。因此，对该菌株的筛选和发酵优化条件的研究是非常有意义的。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 土样  

取自淮安市中面粉厂附近、淮阴师范学院南苑食堂。

2.1.2 培养基组成和培养条件论文网

富集培养基：可溶性淀粉20 g，NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g，MgSO4•7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4•7H2O 0.01 g，定容至1 L，pH 7.0，在0.12 MPa，121℃下灭菌30 min。

培养条件：250 mL三角瓶中，恒温30℃，摇床150 r/min，培养3 d。

初筛平板分离培养基：生玉米淀粉20 g，NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g，MgSO4•7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4•7H2O 0.01 g，琼脂20g，pH 7.0，121℃灭菌30 min，其中玉米淀粉140℃干灭2 h无菌条件下加入。

培养条件：培养皿中恒温30℃培养3 d。

液体发酵培养基：生玉米淀粉2 g，蛋白胨2 g，NaNO3 3 g，KH2PO4 1 g，MgSO4•7H2O 0.5 g，蒸馏水1 L，pH7.0，121℃灭菌20 min。其中生玉米淀粉在140℃下干热灭菌2 h，然后在常温下无菌操作加入。250 mL的三角瓶，装液量为50 mL。

培养条件：恒温30℃，摇床转速为150 r/min。

试管斜面培养基：生玉米淀粉30 g，NaNO3 2 g，KH2PO4 1 g，MgSO4•7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4 0.01 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 7.0，121℃灭菌20 min。

2.1.3 主要仪器设备

ES-B-5000型电子天平（上海信衡电子有限公司），HD-930型组合式全温摇床（太仓市博莱特实验仪器厂），数显恒温水浴锅HH-8（江苏金坛市亿通电子有限公司），FSH-2A可调高速电动匀浆器（金坛市恒丰仪器厂），台式高速冷冻离心机5810R (艾本德中国有限公司)，SBA-40C型生物传感分析仪（上海方畦有限公司）。

2.2 方法

2.2.1 菌种筛选

富集培养：将8份土样中的每种土样称量5 g，加到20 mL无菌水，震荡制成土壤悬液后静置片刻，取上层液体5 mL加到95 mL富集培养基的三角瓶中，将三角瓶置于30℃，150 r/min摇床震荡培养3 d。

初筛平板分离培养：初筛平板分离培养基121℃灭菌20 min，冷却到60℃，趁热倒平板。从富集培养基三角瓶中各取1 mL菌液，用无菌水进行梯度稀释，稀释后取10-5、10-6、10-7三种梯度各200 μL涂布在平板中，30℃恒温培养箱培养3 d后，测定菌落周围透明圈和菌落直径的比值作为初筛指标。

复筛：初筛培养后，根据初筛平板培养基上菌落周围透明圈的大小，挑取透明圈较大的菌落接入液体发酵培养基的250 mL的三角瓶中，每株3瓶，编号。将三角瓶置于30℃，150 r/min摇床震荡培养3 d。取发酵液测定酶活，记录。将复筛后高产生淀粉糖化酶的菌株进一步分离纯化，斜面保存。文献综述

2.2.2  酶活的测定

样品经稀释后（pH在6-8左右），由定量进样针吸取25 μL，并注入反应池，含有样品的底物在样品室内迅速按照一定比例均匀混合，底物透过酶膜圈的外层与固定化酶层接触并反应，反应放出的H2O2再透过酶膜圈的内层与白金-银电极接触，并产生电流信号，该电流信号与底物浓度成线性比例关系，经微机控制的信号，可直接显示并打印结果。 

葡萄糖  +  H2O   +  O2    葡萄糖酸  +H2O2

测定方法：去上清液用定量进样针慢吸25 μL，快速注入反应池，测出葡萄糖生成量。