牛耳朵幼苗对低温胁迫的生理响应(5)
B：在5ºC的光照培养箱中处理24h，其中1/3幼苗（8盆）在24h的低温处理结束后立即用于测定生理指标，还有1/3幼苗（8盆）重新置于25ºC，光照16h黑暗8h下恢复生长24h后测定生理指标，另一部分1/3幼苗（8盆）重新置于25ºC，光照16h黑暗8h下恢复生长48h后进行生理指标测定。
C：在5ºC的光照培养箱中处理36h，其中1/3幼苗（8盆）在36h的低温处理结束后立即用于测定生理指标，还有1/3幼苗（8盆）重新置于25ºC，光照16h黑暗8h下恢复生长24h后测定生理指标，另一部分1/3幼苗（8盆）重新置于25ºC，光照16h黑暗8h下恢复生长48h后进行生理指标测定。
本实验共重复三次（12h，24h，36h）。生理指标的测定分别为：Fv/Fm的测定、叶片含水量的测定、电解质外渗率的测定、SOD（超氧化物歧化酶）活性的测定、MDA（丙二醛）含量的测定。
2.5 各项生理指标测定方法
2.5.1 PSII光化学效率（Fv/Fm）的测定
Fv/Fm 是叶绿素荧光的重要参数，也是植物潜在最大光合能力，利用PAM2500型叶绿素荧光仪测定可变荧光（Fv）和最大荧光（Fm）的比值来表征。本实验中，在需要测定的牛耳朵中选取完全伸展的叶片，暗适应30min后分别测定，每个处理重复测定3次，最后取平均值。
2.5.2 叶片含水量的测定
因为植物体内自由水与束缚水的比值和水分含量与植物抗寒性有密切的关系[22]，所以本实验中将对牛耳朵叶片处理前后相对含水量进行测定。分别取不同处理中相同中叶部位的叶片，用吸水纸擦净后称鲜重记为M1，随后用信封装好放入80ºC烘箱， 烘干约12小时至恒重，称取干重记为M2，每个处理3个重复。计算公式为：叶片含水量=（M1-M2）/M1×100%
2.5.3 电解质外渗率的测定
电解质外渗率（REC）是研究植物抗逆境能力大小的一个重要的生理指标。本文采用宋松泉（1997）的方法[23]：首先取回适量叶片用自来水冲洗干净后用蒸馏水漂洗几遍，然后用滤纸吸干，在舒展的叶片上用孔径6mm的打孔器打孔，用天平称取0.5g放入小烧杯，加入50ml蒸馏水，于30ºC的环境下静置24h，每隔一段时间用玻璃棒搅拌数次。用电导率仪测量初始电导率记为C1，然后放入沸水浴煮沸30min，自然冷却至室温后再测其电导率记为C2，每个处理重复3次。计算公式为：REC=C1/C2×100%
2.5.4 SOD活性的测定
超氧化物歧化酶（SOD）广泛存在于植物体内，且在植物体内的水平高低意着衰老与死亡的直观指标，本文也将其作为牛耳朵对低温胁迫生理响应的一项重要指标。
首先，称取0.50g去脉叶片置于预冷的研钵中，分别加入1 mL和0.6 mL（共1.6ml）的50mmol/L、pH为7.8已预冷的磷酸缓冲液后，在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管，在4ºC、12000 rpm下离心20 min，得到的上清液即为酶粗提液。取粗提液200ml，采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法[24]，用分光光度计测量各管吸光度后，计算结果，测定超氧化物歧化酶（SOD）活性。计算公式为：SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)
其中，Ack：光照对照管的吸光度，AE：样品管的吸光度，V：样品液总体积，Vt：测定时样品用量，W：样品鲜重
2.5.5 MDA含量的测定
丙二醛（MDA）是膜脂过氧化最重要的产物之一，植物在逆境下遭受伤害与活性氧积累诱发的膜质过氧化作用密切相关。因此，其测定量常常可直接反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度与植物的抗逆性。
本文的测定步骤为：称取不同叶位叶片切段0.3g放入研钵中，加入少许石英砂和2mL0.05mol•L-1磷酸缓冲液，研磨成匀浆。将匀浆转移到试管中，再用3mL0.05mol• L-1磷酸缓冲液，分三次冲洗研钵，合并提取液。在提取液中加入5mL0.5 %硫代巴比妥酸溶液，摇匀。将试管放入沸水浴中煮沸10 min（自试管内溶液中出现小气泡开始计时）。到时间后，立即将试管取出并放入冷水浴中。待试管内溶液冷却后，转入离心管中在3000 rpm下离心20min，取上清液2ml于分光光度计测量。本方法采用硫代巴比妥酸比色法来测定丙二醛（MDA）的含量
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