摘要花青素合成酶（anthocyanidin synthase, ANS）在花青素的生物合成中起着重要的 作用。从紫色叶片中提取 RNA，经过逆转录得到 cDNA，使用 PCR 法扩增出 ANS 基因。将目的基因与 pMD 18-T Vector 连接，用以保存该基因。通过调节内参基因 ACT， 比较不同颜色叶片的花青素合成酶含量，得到花青素合成酶含量与叶片颜色的关系。 使用 SalⅠ与 EcoRⅠ两种不同的限制性内切酶进行酶切目的基因与载体，再利用 T4 DNA 连接酶将它们的黏性末端连接，可将 ANS 与 pRI 101 载体重组起来。之后构建 农杆菌转化体系，将载体转入矮牵牛无菌叶片。用含细胞分裂素和抗生素的 MS 培养 基培养外植体，得到不定芽，再培养不定芽长成植株。最后经过 PCR 法检测，确定 花青素合成酶基因成功转入矮牵牛。82337

关键词： 桑树花青素合成酶基因 ANS；内参基因；植物表达载体构建；农杆菌介 导；矮牵牛

Abstract Anthocyanin synthase (ANS) plays an important role in the anthocyanin biosynthesis pathway。 After extracting RNA from the purple leaf, and obtaining cDNA by reverse transcription, we should amplify ANS gene by PCR method。 The target gene was connected with pMD 18-T Vector to save the gene。 By adjusting the reference genes ACT

and to compare the different colors of the leaves of anthocyanidin synthase content, we knew the relationship between anthocyanidin synthase content and leaf color。 Using SalⅠ and EcoRⅠ, two kinds of different restriction enzyme, to cut the target gene and the vector,

and then using T4 DNA ligase to connect the cohesive end, we successfully reconstructed the pRI 101 and ANS。 After that, we can put the vector into Petunia leaves with Agrobacterium transformation system。 After getting adventitious buds by cultivating explants in MS medium containing cytokinin and antibiotics, we can cultivate it into plants。 Finally we knew whether anthocyanidin synthase gene was transferred into Petunia or not by the PCR。

keywords: mulberry anthocyanin synthase gene ANS; reference gene; construction of plant expression vector; Agrobacterium mediated; Petunia

目 录

第一章 绪论 1

1。1  桑树的研究 1

1。2  花青素的研究 2

1。2。1 花青素简介 2

1。2。2 花青素的生物合成途径 3

1。2。3 应用：分子花卉育种 10

1。3  矮牵牛的研究 11

1。4  实时荧光定量 PCR 中内参基因的研究 11

第二章 材料与方法 13

2。1  材料与试剂 13

2。1。1 材料 13

2。1。2 菌种及质粒 13

2。1。3 试剂 13

2。1。4 器皿与仪器 13

2。2  方法 13

2。2。1 基因的克隆与测序 13

2。2。2 ANS 基因表达量的测定 18

2。2。3 植物表达载体的构建 19

2。2。4 农杆菌介导的 ANS 基因转化矮牵牛 23

第三章 结果与分析 28

3。1  基因的克隆与测序结果与分析 28