本课题拟通过纯化筛选得到能有效降解农药多菌灵的菌株，并研究其生物学特性和降解特性，可为通过生物修复多菌灵污染提供理论依据，同时为我国的环保事业做出贡献。分离出降解菌株之后优化其培养条件，为其更好地修复多菌灵污染提供理论支持。

1。 材料与方法

1。1 培养基与试剂

多菌灵原药（含量99%），来自于江苏新沂农药厂；2-氨基苯并咪唑（纯度98%）和2-羟基苯并咪唑(纯度98%)购自百灵威科技有限公司。 

基础盐培养基MSM(g·L-1)：NaCl 0。50 g，(NH4)2SO4 1。00 g，K2HPO4 1。50 g，KH2PO4 0。50 g，MgSO4·7H2O 0。20 g，去离子水1000 mL，pH7。0。

富集分离培养基: 向基础盐培养基中添加多菌灵原药，具体浓度视实验情况。

LB 培养基 (g·L-1): 胰蛋白胨 10。00 g，酵母粉 5。00 g，NaCI 10。00 g，去离子水 1000 mL。

氨苄青霉素(Amp)工作浓度为100 μg·mL-1，卡那霉素(Km)工作浓度为50 μg·mL-1，二氯甲烷、甲醇等，购自南京辉亚生物科技有限公司。

r-Taq DNA聚合酶、2×GC Buffer I、dNTP、DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶、pMD19-T vector和Solution I均购自TaKaRa公司(Dalian, China)。

引物合成和测序委托南京一道生物科技有限公司；质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自杰瑞公司。其他试剂为分析纯，购自南京辉亚生物科技有限公司

1。2 菌株与质粒

本研究中所使用和构建的质粒及菌株特性见表1。

表1 本研究中所使用的菌株和质粒

菌株和质粒 基本特性 来源

        菌株

E。 coli DH5α F-recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsrdR17 supE44 relA1 deoRΔ(lacZYA-argF)U169 实验室

Mycobacterium sp D3 降解菌，30℃培养，DNA做模板 本工作

质粒

pMD19-T vector Ampr, cloning vector TaKaRa

1。3 多菌灵降解菌株的分离、筛选及鉴定

1。3。1 多菌灵降解菌的分离

使用无机盐培养液，多菌灵为唯一碳源，且浓度为30 mg·L-1进行富集培养，加入5。0 g长期施用多菌灵的土壤，在30℃摇床150 rpm中培养7天后传代，总计传代4次，并检测富集液中多菌灵的含量。

1。3。2 多菌灵降解菌的筛选

将传代后有效果的富集培养液以10-3～10-8进行稀释，然后在含有100 mg·L-1多菌灵且为唯一碳源的无机盐培养基平板上涂布，30℃培养箱倒置培养2~3天至单菌落出现，挑取不同形态特征的单菌落，在LB液体试管中培养，将培养液离心洗涤后重悬作为种子液，在无机盐培养基中测定降解效果。

1。3。3 菌株基因组总DNA的提取

细菌的总DNA提取利用细菌总DNA小量提取试剂盒，具体方法见试剂盒说明书。试剂盒购自天根生物技术有限公司。

1。3。4 降解菌株16S rDNA基因序列的鉴定文献综述

1。3。4。1 菌株16S rDNA基因序列扩增

用细菌的基因组DNA作为摸板，用通用引物27F和1492R扩增菌株的16S rDNA序列。

引物：forward primer: 5' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'

reverse primer: 5' TACGGCTACCTTGTTACGACTT 3'

PCR体系 50 μl

模板 1 μl

r-Taq (5U· μl-1) 0。5 μl