10×Taq缓冲液 5 μl

dNTP (25 mmol·L-1) 4 μl

正引物 (25 mmol·L-1) 1 μl

反引物 (25 mmol·L-1) 1 μl

Mg2+(25 mmol·L-1) 4 μl

超纯水 33。5 μl

PCR反应条件：95℃，5 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min 15 s；循环28次，72℃ 延伸5 min；10℃降温2 min。

1。3。4。2 对PCR产物进行TA克隆

PCR扩增产物为1。5 kb左右的单一条带，回收目的片段。回收的DNA片段酶连至pMD19-T载体，16℃过夜。

酶连体系 10 μl

PCR回收产物 3 μl

T4 Ligase 0。5 μl

10×T4 ligation Buffer 1 μl

pMD19-T载体 0。5 μl

超纯水 5 μl

1。3。4。3 质粒DNA的小量提取

平衡吸附柱：取吸附柱加入200 μl buffer CBS，12000 r·min-1 去废液。取2~4 mL菌液，8000 r·min-1弃上清。加250 μl Solution I，用移液枪重悬。再加入250 μl Solution II，立刻小心并完全地翻转4~6次，从而最大化地裂解菌体，最后形成透明的蛋清状溶液，该过程不长于5 min。加入350 μl Solution III 温和充分翻转8~10次室温放置5~10 min，12000 r·min-1离心5~10 min。准备吸附柱并套有2 mL的收集管，取上清于吸附柱内并6000 r·min-1 离心1 min，除去废液。再往吸附柱中加入500 μl W1 Solution 12000 r·min-1 离心1 min，倒掉废液，在吸附柱中加500 μl Wash Solution。重复用Wash Solution 再洗一次。倒掉废液，12000 r·min-1离心彻底去除Wash Solution，在无菌台上晾5 min。往洁净的1。5 mL离心管套上将吸附柱，对准中心打入30 μl ddH2O。置于37℃,2 min，12000 r·min-1 离心1 min，离心管中得到提取的质粒。

1。3。4。4 降解菌株16S rDNA基因序列测定

挑取转化后能在100 mg·L-1 Amp LB固体培养基上存活单菌菌落，在含有Amp的LB液体试管中培养，在37℃摇床160 rpm条件下培养10~12 h，提取质粒并进行PCR分析，测量准确插入的转化子序列。测序委托南京一道生物科技公司。

1。3。4。5 降解菌株系统发育地位的确定

根据16S rDNA基因的测序结果，登录NCBI进行在线查询分析，同时使用原核生物鉴定数据库EzBioCloud 进行在线比对[16]，下载同源性较高的16S rDNA基因序列，将序列导入MEGA 5。0 软件中，用邻接法构建降解菌株的16S rDNA基因系统发育树[17]。来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com

1。4 降解菌株生长量的测定

挑取降解菌株接入LB液体培养基，30℃摇床150 r·min-1培养至对数后期作为种子液。使用分光光度法测定菌株的生长量，OD600表示波长λ=600 nm处的光密度。将定时取样的菌液经6000 r·min-1离心5 min，取去离子水洗涤菌液，离心洗涤重复两次，最后加入等体积无菌水重悬后测定生长量。

1。5 菌株D3对多菌灵降解的研究

1。5。1 测量方法

紫外扫描法：在MSM培养基中接种降解菌株进行培养后，用同等体积的二氯甲烷进行萃取，剧烈混匀5~10 min，静置分层，吸取下层有机相，使用过量的无水硫酸钠去除待测液中的水分。在波长200~350 nm内用紫外-可见分光光度计进行扫描。根据其特征吸收峰的高低来初步判断多菌灵的降解情况。

高效液相色谱法（HPLC）：取1。0 mL紫外扫描法中的样液至洁净的1。5 mL离心管，在通风橱中待溶剂挥发。加入1。0 mL甲醇溶解，让0。22 μm的有机相滤器进行杂质过滤。液相色谱条件：液相色谱仪型号为岛津RID-10A；液相色谱柱为C18反相柱，规格为250 mm×4。6 mm×5 μm；流动相为甲醇∶乙腈∶乙酸（30∶20∶0。5）；柱温为40℃；流速为1。0 mL•min-1；检测波长为240 nm和280 nm。