电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司 DKZ-450B

加热磁力搅拌器 JKIKA WERKR RCT basic

微量移液器(移液枪) GILSON pipetman 2ul/10ul/100ul/200ul/1000ul

离心机 Eppendorf centrifuge 5418/5810R

微量紫外分光光度计 BioSpec-nano UV-2401PC

聚丙烯酰胺凝胶电泳系统装置 北京市六一仪器厂 NDCZ-24D

PCR仪 Eppendorf AG 22331 Hamburg

2。3主要实验试剂和部分溶液配方

本实验所涉及主要实验试剂有1×TBE缓冲液、0。1%AgNo3r溶液、NaOH溶液、甲醛、6%PAGE、40%PAGE、Mix、primer-F、primer-R、ddH2O、蒸馏水。

3。实验方法

3。1小酸浆DNA提取

使用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）对82个样品进行DNA的提取。具体提取步骤如下：

①取新鲜的小酸浆叶片1-2片，约50-100mg，于液氮中充分研磨成细小的冻干粉沫，随后将其转移至1。5ml的尖头离心管内，粉末体积占离心管体积的1/3。

②加入1ml的CTAB于离心管内，随后以恒温4℃，12,000rpm的转速离心8分钟。同时在事先设置好65℃的水浴锅内开始预热Buffer PCB。

③取出离心管，用1000ul的枪吸去上清液并弃之，于管中加入600μl事先预热的Buffer PCB以及12μl的β-巯基乙醇，于涡旋振荡仪上混匀或手动颠倒混匀，随后室温下静置2分钟。

④2分钟后，加入与Buffer PCB等体积的600μl氯仿（三氯甲烷），并颠倒离心管，使之充分混匀，4℃恒温，12,000rpm转速下离心5分钟，之后取出，吸取200μl上清液至一个新的干净的1。5ml尖头离心管当中，注意不要吸到中间层变性的蛋白质部分。论文网

⑤加入与上清液等体积的200μl的Buffer BD 颠倒混匀3-5次以及与之等体积的200μl无水乙醇，使其充分颠倒混匀后用1000μl移液枪将其全部加入到吸附柱中，室温下静置2分钟，以10,000rpm的转速离心1分钟，弃去收集管中的废液。

⑥将吸附柱放回收集管当中，用1000μl移液枪加入500μl的PW Solution，在10,000rpm转速下离心1分钟倒掉收集管里的废液，注意PW Solution使用前要事先加入所要求比例的异丙醇。

⑦将吸附柱放回收集管之中，加入500μl的Wash Solution，以10,000rpm的转速离心1分钟，并倒掉收集管中的废液。Wash Solution使用前要加入适量比例的无水乙醇。

⑧将吸附柱放回收集管中12,000rpm的转速离心2分钟。此步骤很重要，可去除残余的无水乙醇，避免影响DNA纯度。

⑨将吸附柱盖子打开，在操作台中风干10-15分钟，彻底晾干吸附柱中所残留的Wash Solution，以避免影响DNA产量及后续的实验。

⑩取出吸附柱，放入新的1。5ml的尖头离心管中，于吸附膜中加入50μl的TE Buffer，室温静置3分钟，再在12,000rpm的转速下离心2分钟，得到的DNA 溶液储存于-20℃的冷藏箱中，避免变性而影响实验。

3。2 DNA的质量与浓度检测

利用生命科学紫外可见分光光度计（BioSpec-nano，UV-2401PC）法来检测DNA浓度含量和纯度：取2ul DNA样品在紫外分光光度计上点样，检测波长在260nm和280nm时的吸收值。读取DNA浓度值，一般在40-70ng/μl, DNA纯度的高低是依据OD260/OD280的比值是否在1。8-2。0的范围之内而定的。随后，对DNA检测结果未满足要求的小酸浆样本进行重提，最后，将符合要求的DNA样品浓度稀释到25 ng•μL-1（一般DNA与水的比例为20比40），最终置于–20 ℃的冰箱冷藏室进行备用保存。