2。2实验方法7

2。2。1转基因小鼠基因型鉴定7

2。2。2转基因小鼠取脑组织8

2。2。3Western blot鉴定小鼠大脑各脑区神经元和胶质细胞特异蛋白表达量8

2。2。4免疫荧光鉴定各种胶质细胞和神经元的分布和数量12

3、结果12

4、讨论17

5、致谢18

6、参考文献18

第一章 前言

1。1癫痫小鼠模型的研究进展

癫痫是最常见的一种神经系统疾病，发病率较高影响全球大概5千万人口，目前已知它是由多种原因引起的慢性脑功能障碍临床综合征，细胞水平表现为大脑神经元细胞群反复超同步放电所引起的突然性、反复性、短暂性脑神经系统功能紊乱。癫痫发生部位为颞叶，额叶等部位，[10]而颞叶癫痫（TLE）是成人局灶性癫痫中最常见的形式占癫痫患者的25%-50%。新近研究发现，抑制性中间神经元的缺损、异常突触的形成、胶质细胞的增生炎性因子的浸润等在TLE发病中发挥重要作用，其中抑制性中间神经元的缺损是TLE主要的发病机制之一。痫小鼠模型的建立为研究其发病机制与发展新型治疗手段作为一种高效模拟工具。论文网

近几年国内外专家以癫痫小鼠作为模型研究癫痫发病机制，但就神经元变性，胶质细胞数量与分布没有具体明确，将其作为本实验研究重点。[11]近些年来许多学者通过体外扩增基因等研究发现在许多癫痫综合征患者都存在编码γ-氨基丁酸(GABA)A型受体γ亚单位的基因异常，进而提出了GABRG2基因异常与多种癫痫的发病有关。内侧颞叶癫痫患者常有高热惊厥史，二者之间关系密切，在持续的高热惊厥发作后会出现海马结构的异常，而内侧颞叶癫痫最重要的病理改变亦或者是发病原因就是海马结构硬化。原先从Riken引进的PV-tTA小鼠与Jackson Lab引进的Tet-ErbB2小鼠用于观察两者的杂交后代中ErbB2的表达情况。其中tTA能与TRE结合，启动TRE调控的基因转录，PV神经元是抑制性中间神经元，能在神经元兴奋时起适度的抑制作用，从而防止神经元的过度兴奋。[4]PV不足时容易影响网络性质，从而容易增加癫痫发作的几率。而Tet-ErbB2中的ErbB2V664E表达的蛋白在跨膜肽段调控形成 二聚体的结构发生一个氨基酸突变，该突变体与其他的ErbB形成二聚体能力更强，切不需要配体，能够自我磷酸化，激活下游同路。[8]实验中用到Tet-off系统进行基因调控，该系统在有DOX（类四环素）的情况下是的目的基因不表达；在无DOX时目的基因表达发生明显变化，产生较高的诱导效率，并且需要在小鼠以后喂药，因为如果后代中含双基因，并且在胚胎期喂药，容易致使胚胎死亡。而在上面提到的两个实验室引进的小鼠进行杂交，然而在其杂交后代中发现有与其他正常小鼠不一样的表型，发现其表型弱小，四肢无力，偶发癫痫症状因此将其作为新课题进行研究。研究癫痫发生中PV神经元异常的发生机制，并且希望从其中初步了解到致使PV-tTA;TetRE-caErbB2小鼠发生癫痫的细胞和分子机制。由于癫痫症状在全球也属于多发性疾病，这个研究成果能构成为医药临床医治癫痫病人的理论依据。

1。2预设实验流程图

 根据实际情况以及文献确定检测动物基因型使用WB与IF进行鉴定PV细胞是否有发生异常。

第二章 基于PV神经元异常的癫痫小鼠模型的构建

2。1实验材料

2。1。1实验动物

   从 Riken引进的PV-tTA小鼠与Jackson Lab引进的Tet-ErbB2小鼠，并在SPF级动物中心饲养，待母鼠怀孕后根据实验目的进行喂食含DOX的水。

2。1。2药品